HuR蛋白介导的mRNA稳定性糖尿病大鼠骨髓巨噬细胞中对炎症因子Il-6高表达的影响

摘要

目的：本实验选用GK糖尿病大鼠与Wistar正常大鼠分离培养骨髓巨噬细胞(bonemarrow-drive macrophage，BMM)，分别在高糖和正常培养基中培养，利用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导建立炎症模型。应用放线菌素D抑制IL-6的转录水平观察高糖对转录后IL-6mRNA的稳定性影响，并对其作用机制进行初步探讨。
　　方法：通过分离大鼠骨髓细胞(bone marrow cell，BMC)诱导分化成巨噬细胞，LPS刺激建立炎症模型；在倒置显微镜下进行细胞形态学观察，并对分化成熟的巨噬细胞进行免疫组化鉴定；实验分为：GK高糖组、Wistar正常组；ELISA试剂盒测细胞上清中炎症因子IL-6的含量；实时荧光定量PCR(Real-Time PCR，RT-PCR)检测IL-6mRNA水平；Western Blot测定人抗原R(Human antigen R，HuR)蛋白的胞浆胞核及其总表达水平；RNA结合蛋白免疫沉淀技术(RNA-binding proteinimmunoprecipitation，RIP)检测HuR-mRNA复合物中IL-6mRNA含量。
　　结果：原代培养的骨髓巨噬细胞生长良好，光镜下可观察到细胞贴满培养板底呈椭圆形、三角形、星形或不规则形，有许多伪足和突起，胞浆丰富；共聚焦显微镜下观察SP法对骨髓巨噬细胞鉴定CD68阳性表达率达99％以上；ELISA结果显示炎症因子IL-6的水平在高糖组高于正常组，两组间差异有统计学意义；RT-PCR显示在高糖组IL-6mRNA的相对含量高于正常组，两组间比较差异有统计学意义；Western Blot显示正常对照组胞浆HuR的表达含量随LPS刺激时间变化差异无统计学意义，高糖组胞浆HuR的水平随LPS刺激的时间延长逐渐增加，胞核HuR的水平逐渐降低，两组间胞浆胞核总HuR蛋白表达水平比较差异无统计学意义；RIP检测显示HuR-mRNA复合物中IL-6mRNA含量高糖组高于正常对照组，两组间比较差异有统计学意义。
　　结论：本实验通过利用LPS诱导的体外炎症模型，并利用放线菌素D抑制IL-6mRNA的转录水平，证实了高糖通过RNA结合蛋白HuR从转录后水平调控IL-6mRNA的稳定性，使IL-6mRNA稳定性增强。