siRNA靶向沉默OCT4基因对前列腺癌DU145细胞和PC3细胞增殖、凋亡、侵袭的影响

摘要

目的：使用siRNA靶向沉默人前列腺癌DU145细胞和PC3细胞OCT4基因的表达，观察OCT4基因的沉默对DU145细胞和PC3细胞的增殖、凋亡及侵袭力等生物学行为的影响，为进一步从分子水平阻断前列腺癌发展提供靶基因。
　　方法：(1)设计并体外化学合成3对针对人OCT4基因的特异性siRNA和1对绿色荧光素标记的FAM-siRNA作为阴性对照序列。(2)通过使用脂质体(LipofectaminTM2000)将FAM-siRNA分别转染入人前列腺癌DU145细胞和PC3细胞;通过荧光显微镜检测表达绿色荧光素的两种细胞，评估siRNA转染效率。(3)利用脂质体转染法将各3对siRNA分别转染入DU145细胞和PC3细胞，设置空白对照组和阴性对照组，收集转染48h后的两种细胞，分别提取总RNA和总蛋白，使用RT-PCR和Western blot技术分别检测OCT4 mRNA及蛋白表达水平，筛选有效靶点。(4)将筛选出的最佳干扰序列siRNA-1分别转染入DU145细胞和PC3细胞，采用CCK-8法检测siRNA对DU145细胞和PC3细胞增殖的影响，Annexin V-PI法检测细胞凋亡情况，Transwell实验检测细胞的侵袭能力的变化。
　　结果：(1)荧光显微镜观察检测显示，FAM-siRNA转染效率DU145细胞约92％，PC3细胞约94％。(2) RT-PCR结果显示，两种细胞的电泳结果均见实验组OCT4 mRNA的表达低于阴性对照组和空白对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，其中均以siRNA-1转染组下调最明显，选为最佳特异性siRNA。Western blot结果显示两种细胞的siRNA-1实验组OCT4蛋白的表达水平均低于阴性对照组和空白对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。(3) CCK-8法检测转染后24h、48h、72h三组细胞增殖水平，根据测定的OD值评估各组细胞的增殖情况，发现24h、48h、72h时，siRNA-1组OD值与空白组和NC组相比，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，计算siRNA-1组转染24h，48h和72h抑制率，我们发现72h抑制率最高，DU145细胞为(33.8±3.2)％，PC3细胞为(38.4±5.1)％。(4)流式细胞仪技术测转染后48h细胞凋亡率，结果显示:DU145细胞转染siRNA-1组凋亡率为(47.61±2.92)％，PC3细胞转染siRNA-1组凋亡率为(27.36±4.19)％，与各自的空白组和NC组相比较，凋亡率均增高(P＜0.05)，而空白组和NC组细胞凋亡率差异无统计学意义(P＞0.05)。(5) Transwell法测转染后24h三组细胞侵袭力，结果显示:siRNA-1组穿过Matrigel胶的细胞数明显少于空白组和NC组(P＜0.05)，而空白组和NC组之间无明显差别(P＞0.05)。
　　结论： siRNA有效地阻断了前列腺癌DU145细胞和PC3细胞中OCT4基因的表达，OCT4基因在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调(P＜0.05），并抑制细胞的增殖，诱导细胞发生凋亡，同时降低肿瘤细胞的侵袭能力。抑制OCT4基因的表达可能成为临床治疗激素非依赖性前列腺癌的方法之一。

目录

研究生个人简介

缩略词表

摘要

前言

材料和方法

1 材料

2 方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 OCT4基因与肿瘤关系的研究

攻读硕士学位期间发表学术论文题目

临床培训小结

致谢

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