B16黑色素瘤培养上清体内外抗瘤作用及其机制

摘要

目的：B16黑色素瘤细胞培养上清不同分子量的分离纯化片段对C57BL/6小鼠脾淋巴细胞的趋化能力;使用不同的分离纯化片段、冻融B16细胞、培养上清原液和RPMI1640培养基免疫C57BL/6小鼠，之后建立B16黑色素瘤移植瘤模型，观察以上物质的抑瘤作用的差异，以及瘤内浸润淋巴细胞和脾淋巴细胞的亚型、两种淋巴细胞杀伤能力和不同组别移植瘤的形态学特点。
　　方法：实验设计B16细胞培养上清分离纯化片段的体内外抗瘤作用，第一部分:体外实验;收集无血清培养24 h的B16细胞培养上清，用超滤离心管将其分为以下7个片段:Ⅰ3-5kD;Ⅱ5-10KD;Ⅲ10-30kD;Ⅳ30-50kD;Ⅴ50-100kD;Ⅵ100-300kD;Ⅶ＞300kD，进行SDS-PAGE。使用50-100kD片段和100-300kD片段，及培养上清原液和RPMI1640进行趋化实验，分离提取C57BL/6小鼠脾淋巴细胞，采取Boyden小室方法进行趋化实验，趋化时间分为0.5h、2h、4h、8h、12h、24h，每组设4个复孔，RPMI1640作为空白对照，收集下室淋巴细胞并计数，同时使用荧光抗体标记下室趋化的淋巴细胞，鉴定已趋化淋巴细胞中Treg的含量。第二部分:动物实验;将40只清洁级6-8周的C57BL/6小鼠随机平均分为5组，每组8只，分别应用50-100kD纯化片段、100-300kD纯化片段、反复冻融的B16细胞、培养上清原液和RPMI1640培养基对小鼠进行预免疫，采取左侧腋下皮下免疫的方法，每周一次，连续免疫两次，第二次免疫之后一周在各组小鼠右侧腋下进行B16细胞（1×106个/ml）的接种，隔日观察小鼠的生活习性以及肿瘤的生长情况，接种两周之后处死小鼠解剖取瘤，测量肿瘤长短径并称取肿瘤质量，分离肿瘤内浸润淋巴细胞以及脾脏内淋巴细胞，采用CCK-8方法检测两种类型的淋巴细胞体外杀伤B16细胞的能力，并采用流式细胞仪检测两种类型的淋巴细胞的亚型，HE染色观察不同组别移植瘤和肺的形态学特征。
　　结果：1.肿瘤培养上清分离纯化后，SDS-PAGE凝胶电泳看到B16培养上清中的蛋白大部分集中在70kD左右，少量蛋白在130kD-250kD之间，其他泳道没有看到明显的条带。
　　2.1趋化实验表明，随着趋化时间的延长，两个片段纯化蛋白和原液以及RPMI1640培养基趋化淋巴细胞数目逐渐增多，在趋化12h时细胞数目达到最大，趋化24h时已趋化存活淋巴细胞数目减少，主要是由于淋巴细胞自身死亡引起。在12h时，50-100kD趋化淋巴细胞数目最多（91.33±3.21）×104/ml，与同一时间点RPMI1640组相比具有统计学差异（P＜0.05），100-300kD次之（77.33±2.52）×104/ml，而原液组趋化的淋巴细胞数与对照组相比没有统计学差异（P＞0.05）。
　　2.2免疫荧光标记趋化至下室的淋巴细胞，发现50-100kD组趋化的Treg数目较其他三个组多，且趋化的细胞数目随趋化时间的延长而增多，当趋化至12h，细胞数目达到最大（23.00±2.65）×104/ml，与同一时间点RPMI1640组相比具有统计学差异（P＜0.05），100-300kD组次之。
　　3.1分离纯化片段、反复冻融的B16细胞、培养上清原液和RPMI1640培养基免疫C57BL/6小鼠之后小鼠没有出现异常的生活习性的改变，接种B16细胞之后第6天五组小鼠均长出肿瘤，成瘤率100％，50-100kD组肿瘤生长最慢，其次是反复冻融组、100-300kD组、原液组，其中RPMI1640组生长最快，在相同的时间点与50-100kD组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）;接种2周后处死小鼠之后发现50-100kD组肿瘤体积最小，为（520.15±36.69）mm3，质量为(1323.75±27.54)mg，与RPMI1640组相比差异具有统计学意义（P＜0.05），反复冻融组次之，以RPMI1640组体积和质量最大，分别为（2363.50±43.05）mm3、（2593.75±95.65）mg。所有小鼠在处死之前没有意外死亡。
　　3.2 CCK-8实验表明，同一动物组别肿瘤内浸润的淋巴细胞的杀伤活性明显的强于脾淋巴细胞，且随着效靶比的增加杀伤活性而增加;不同动物组别中，其瘤内浸润的淋巴细胞和脾脏淋巴细胞的杀伤活性以50-100kD组最强，50-100kD组在效靶比为50∶1时，TIL的杀伤活性是（0.82±0.026），较100-300kD组、RPMI1640组、原液组明显的增多，差异均具有统计学意义（P＜0.05），其次是反复冻融组，以RPMI1640组最弱，且随着效靶比的增加杀伤活性增强;脾淋巴细胞的杀伤活性为（0.67±0.029），较100-300kD组、RPMI1640组、原液组明显的增多，差异均具有统计学意义（P＜0.05）;
　　3.3流式细胞检测结果表明，同一动物组别瘤内浸润淋巴细胞中CD28+CD8+T淋巴细胞的比例明显的多于相应组别脾淋巴细胞;不同动物组别中，对于瘤内浸润淋巴细胞，以50-100kD组含有较多的CD28+CD8+T淋巴细胞，为39.61％，其次是反复冻融组，RPMI1640组最少，50-100kD组含有较多的CD28+CD4+T淋巴细胞，为47.76％;对于脾淋巴细胞，100-300kD组含有CD28+CD8+T淋巴细胞最多，为18.7％，以原液组含有CD28+CD4+T淋巴细胞最多，达19.8％，各组别的肿瘤内浸润淋巴细胞所含有的CD20+B淋巴细胞的总数差异不明显。
　　3.4 HE染色结果表明，各组别小鼠均未出现B16黑色素瘤远处脏器肺脏的转移，但是均出现了局部腋下淋巴结的转移，以RPMI1640组最多，50-100kD组最少，RPMI1640组移植瘤内出现出血坏死，其他组别未见出血坏死;显微镜下观察表明，各个组别的移植瘤均出现较大的瘤细胞的异型性，肿瘤细胞分化成熟障碍，其中以RPMI1640组最为明显，以50-100kD组肿瘤细胞分化较好。
　　结论：通过以上体内体外实验可以得出以下结论:1、B16细胞无血清培养时能合成和分泌某些蛋白物质，这些蛋白片段在体外对淋巴细胞具有趋化作用。趋化作用与趋化时间以及蛋白片段的大小有关。2、应用肿瘤培养上清中不同分子量片段、反复冻融B16细胞免疫C57BL/6小鼠，能够产生一定的抑瘤效应，其中以50-100kD片段效果最好，其次是反复冻融的B16细胞，结合此时瘤内CD28+CD8+T淋巴细胞较多，同时该种T淋巴细胞具有较强的体外杀伤活性，考虑抑瘤作用是通过蛋白片段和冻融细胞碎片活化CD8+T淋巴细胞和促进肿瘤细胞分化成熟而实现的。

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前言

材料和方法

1 材料

2 方法

3 数据处理

结果

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结论

参考文献

肿瘤免疫抑制机制的探讨 综述

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