低氧对新生小鼠心脏成纤维细胞增殖与表型的影响及其表型转化机制的实验研究

摘要

目的：探讨低氧对新生小鼠心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFs)增殖与表型的影响及其表型转化的相关机制。
　　方法：体外分离培养新生小鼠CFs，通过倒置显微镜观察其形态，同时运用免疫荧光染色和流式细胞技术检测CFs特异性的标记物盘状结构域受体2(DiscoidinDomain Receptor2，DDR2)。分别应用Real-time RCR和Western Blot方法检测低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)的表达。RT-CES系统监视CFs的生长状况；CCK-8法检测CFs的增殖情况。分别通过Real-time RCR、免疫荧光染色、流式细胞技术和Western Blot技术从核酸和蛋白水平检测CFs向心脏肌成纤维细胞(cardiac myofibroblasts，CMFs)表型转化的标记物α-平滑肌激动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)。运用Western Blot技术检测JNK的磷酸化水平。
　　结果：1.CFs的纯度鉴定：分离培养的细胞呈梭形或多角形，胞体及细胞核较大，细胞核呈椭圆形，无自发性搏动，呈现出CFs的典型形态特征。Vimentin和DDR2的免疫荧光染色呈阳性。流式细胞技术检测结果显示，Vimentin和DDR2的阳性率分别为99.94％、94.76%。
　　2.低氧对CFs增殖的影响：常氧组、1%O2组和5%O2组中，CFs持续地表达HIF-1α mRNA，它们之间差异无统计学意义(P>0.05)。与常氧组相比，1%O2组和5%O2组CFs中HIF-1α蛋白的表达显著性增加(P<0.05)。与常氧组相比，在140h时期内，1%O2组CFs的细胞指数值显著性下降；5%O2组CFs的细胞指数值持续性上升，CFs未出现凋亡或死亡现象。与常氧组相比，5%O2组CCK-8 A450nm值显著性增加(P<0.05)；1%O2组CCK-8 A450nm值显著性降低(P<0.05)。
　　3.低氧对CFs表型转化的作用及其表型转化的相关机制：常氧组CFs中α-SMA免疫荧光染色呈微弱阳性，5%O2组CFs中α-SMA免疫荧光染色呈强阳性。Real-time RCR和Western Blot结果显示，与常氧组相比，5%O2组CFs中α-SMAmRNA和蛋白的表达水平显著性增加(P<0.05)。流式细胞技术检测的结果显示，常氧组CFs中α-SMA的阳性率是15.24%，5%O2组CFs中α-SMA的阳性率是88.83%。Western Blot结果表明，5%O2能够显著地诱导JNK磷酸化(P<0.05)；SP600125高效地抑制5%O2诱导的JNK的磷酸化(P<0.05)；SP600125显著性地抑制5%O2诱导的α-SMA的表达(P<0.05)。
　　结论：1.5%O2能够促进新生小鼠CFs增殖，而1%O2对其增殖具有抑制作用。
　　2.5%O2能够促进新生小鼠CFs向CMFs的表型转化，在此过程中JNK信号通路发挥着重要作用。