降钙素基因相关肽话导藻酸钙凝胶复合脂肪干细胞向成骨细胞分化的实验研究

摘要

目的：探讨外源性降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide，CGRP)诱导兔脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells，ADSCs)复合藻酸钙凝胶三维培养构建组织工程化骨的可行性，并为组织工程化骨修复骨缺损提供实验基础。
　　方法：取清洁级3月龄健康新西兰大白兔2只，雌雄不拘，体重2.5～3.5kg。取双侧腹股沟区皮下脂肪垫，Ⅰ型胶原酶消化离心贴壁法分离培养ADSCs，取第三代细胞进行实验。倒置显微镜观察细胞形态及生长情况，采用细胞表面抗原CD44、CD45免疫荧光染色法鉴定ADSCs。调整细胞密度为1×105个/ml与海藻酸钠混合制备凝胶，分为两组:对照组加入含10-2 mol/L-甘油磷酸钠、107mol/L地塞米松、50mg/L抗坏血酸、体积分数为10％的胎牛血清的DMEM/F-12骨诱导培养基，实验组在此基础上加入1.5μg/L降钙素基因相关肽进行诱导培养。MTT法检测细胞增殖情况，分别行碱性磷酸酶、茜素红染色观察及成骨鉴定，RT-PCR法检测诱导细胞Ⅰ型胶原和骨钙素(OC)mRNA的表达，分别于诱导后1，2，3，4周检测两组的碱性磷酸酶(ALP)和钙离子浓度并作统计分析。
　　结果： ADSCs形态多为梭形，呈“漩涡状”排列;表面抗原CD44呈阳性，CD45呈阴性;细胞增殖曲线为“S”型，两组在1，3，5，7，14，21d的光吸收值(OD)比较差异有统计学意义(P＜0.05，n=6);诱导2周后两组细胞碱性磷酸酶、茜素红染色均为阳性，但实验组钙化结节明显较对照组增多。诱导7，14d实验组Ⅰ型胶原和骨钙素mRNA的表达均强于对照组。碱性磷酸酶（或钙离子）浓度在实验组与对照组之间存在组间差异，在各个时间点实验组碱性磷酸酶（或钙离子）浓度均高于对照组(P＜0.05，n=4);实验组碱性磷酸酶（或钙离子）浓度在不同诱导时相其浓度变化的趋势不同(P＜0.05，n=4)。
　　结论：1.Ⅰ型胶原酶消化离心贴壁法是一种有效的分离和培养脂肪间充质干细胞的方法。
　　2.藻酸钙凝胶对细胞的培养是三维培养，藻酸钙凝胶表面积大，内部孔隙多，适合于细胞黏附和进行营养交换，有利于细胞附着，生长，增殖。
　　3.CGRP不仅在成骨细胞体外培养过程中有促进作用，在藻酸钙凝胶载体上同样具有促脂肪干细胞向成骨细胞分化的作用，有望成为骨缺损修复的一种组织工程方法。

目录

研究生个人简介

缩略词表

摘要

前言

材料和方法

1 材料

2 方法

结果

讨论

结论

参考文献

降钙素基因相关肽(CGRP)在骨折修复、重建中的作用 综述

攻读硕士学位期间发表学术论文

临床培训小结

致谢

声明

论文审阅认定书