RNA干扰抑制NCAM140表达对GDNF保护多巴胺能神经元作用的影响

摘要

目的：设计、筛选针对小鼠NCAM140基因的有效RNA干扰序列，构建干扰质粒抑制NCAM140基因表达，同时研究NCAM140基因表达降低后对GDNF介导的MN9D细胞的突起生长的影响。
　　方法：1）使用基因序列软件设计、筛选符合公开文献筛选参数的4条靶序列以及1条阴性对照序列，由上海吉玛技术有限公司合成。与载体质粒pGPU6/GFP/Neo重组后，分别命名为pSi-nca1、pSi-nca2、pSi-nca3、pSi-nca4和pSi-control。转染大肠杆菌感受态细胞。选择阳性克隆进行DNA测序鉴定，Western blot方法进行干扰靶点的筛选。选取干扰效率最高的质粒转染MN9D细胞，普通光学显微镜分别计数同一视野细胞总数及GFP阳性细胞数，计算转染效率。2）筛选的NCAM140有效干扰质粒pSi-nca4转染6-OHDA损伤(200μM)后的MN9D细胞，光镜下测量细胞突起长度实验分组为:空白组、pSi-control组、pSi-nca4组、空白+GDNF组、pSi-control+GDNF组、pSi-nca4+GDNF组;共聚焦显微镜测量转染后细胞突起长度的实验分组为:pSi-control组、pSi-nca4组、pSi-control+GDNF组、pSi-nca4+GDNF;按上述分组，GDNF处理组为GDNF(50ng/ml)持续培养24小时，应用IPP(Image ProPlus)软件测定细胞突起长度。
　　结果：DNA测序结果显示重组质粒中含有所设计的寡核苷酸双链，且序列正确。转染24后，pSi-nca4组NCAM140的蛋白质表达水平较阴性对照组显著下降(P＜0.05)，提示pSi-caa4为干扰效率最高。光镜下计算pSi-nca4的转染效率为62％，光镜下细胞突起长度的析因分析结果显示，GDNF的主效应有统计学意义(F=16.503，P＜0.0001)，pSi-nca4的干扰效应有统计学意义(F=3.835，P=0.036)，GDNF和pSi-nca4的交互作用有统计学意义(F=3.527，P=0.045);空白组与空白+GDNF组的细胞突起长度值分别为:51.66±2.09μm，57.17±2.78μm，(P＜0.05）;GDNF作用下，pSi-control组、pSi-nca4组细胞突起长度分别为:56.89±3.43μm，51.82±2.33μm(P＜0.05)，差异有统计学意义;共聚焦显微镜下测得细胞突起长度数值的析因分析结果显示:GDNF的主效应有统计学意义(F=5.665，P=0.030)，pSi-nca4的干扰效应有统计学意义(F=5.870，P=0.028)，GDNF和pSi-nca4的交互作用有统计学意义(F=5.473，P=0.033);pSi-control与pSi-control+GDNF组的细胞突起长度值分别为49.43±2.71μm，58.48±5.79μm差异有统计学意义(P＜0.05)，pSi-nca4+GDNF组细胞突起长度为49.35±3.54μm，较pSi-control+GDNF组差异有统计学意义。
　　结论：成功设计并筛选了小鼠NCAM140基因的有效干扰片段，成功构建了其干扰载体。从分子生物学角度证实了NCAM140参与介导了GDNF促进多巴胺能神经细胞突起生长的作用，

目录

研究生个人简介

缩略词表

摘要

前言

第一部分 小鼠NCAM140基因有效RNA干扰片段的构建与鉴定

材料和方法

结果

讨论

第二部分 质粒介导的RNAi沉默NCAM140在MN9D细胞中的作用

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 NCAM与神经精神疾病的关系

攻读硕士学位期间发表学术论文题目

临床培训小结

致谢

声明

论文审阅认定书