肝静脉闭塞病中与Notch1信号通路相互作用的lncRNA的筛选及初步验证

摘要

目的：本实验旨在研究Notch1信号通路对异基因造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）后肝静脉闭塞病(hepaticveno-occlusive disease，HVOD)受损肝细胞的修复作用，并通过肝细胞基因芯片筛选与Notch1信号通路相互作用的长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)，并进一步分析lncRNA与Notch1信号通路之间的相互作用关系。
　　方法：1.将8～10周龄雄性BALB/c(H-2d)小鼠经致死剂量全身照射(totalbody irradiation，TBI)后，随机分为TBI组及异基因HSCT组，正常小鼠为对照组。移植当天为0天，分别于移植后第0、7、14及33天取受鼠肝脏称重后计算肝脏指数，留取血浆检测肝功能(胆红素、ALT和AST)及细胞因子（TNF-α、TGF-β、IL-1、IL-6及HGF）;HE染色观察肝脏组织受损情况，电镜观察肝细胞超微结构变化;2.TBI及HSCT后第0、7、14及33天，percoll密度梯度离心法分离、纯化受鼠肝细胞，分别用实时荧光定量PCR及Western blot检测肝细胞内Notch1信号通路相关分子的mRNA及蛋白水平变化;3.提取肝细胞总RNA，经质量及完整性检测后，用于制作肝细胞lncRNA基因芯片;4.对基因芯片数据进行整理、分析，筛选与Notch1信号通路相互作用的lncRNAs，荧光定量PCR检测与Notch1信号通路相互作用lncRNAs的mRNA水平，并进一步分析Notch1信号通路分子与其相互作用lncRNAs的同源性。
　　结果:1.TBI及HSCT对肝脏的损伤:TBI组小鼠在11天内全部死亡，病理显示照射后第7天肝窦内皮脱落、肝细胞水肿并出现少量点状坏死，此时小鼠肝指数水平也达到最高，胆红素、ALT及AST水平高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），至第10天肝细胞损伤进一步加重，肿胀、坏死较前增多，肝窦内有出血，肝小叶结构不清。而HSCT后第7天，受鼠肝细胞损伤较同时间点TBI组小鼠重，至第14天肝细胞损伤最严重，肝细胞肿胀、坏死、肝窦内皮脱落、Disse间隙水肿并肝窦内出血，此时小鼠肝指数水平亦达最高，肝功能较前虽下降，但仍高于正常水平，差异有统计学意义(P＜0.05);至第33天肝细胞损伤虽较前好转，但炎性细胞浸润增多，且受鼠肝指数及肝功能在HSCT后33天内持续高于正常水平，提示移植后肝脏损伤由TBI和HSCT共同引起。2.照射及HSCT后，肝细胞内Notch1通路分子的mRNA水平呈先降后升的趋势，在第14天时降至最低，随后其表达水平升高，Notch1信号通路分子蛋白水平变化趋势与mRNA水平变化趋势相同。3.成功分离、纯化移植后受鼠的肝细胞，并提取肝细胞总RNA，琼脂糖凝胶电泳快速检测RNA完整性良好，可用于基因芯片制作。4.经过对肝细胞基因芯片数据整理、分析，筛选出与差异性表达显著的Notch1通路分子Notch1、Dl14及Hes7相互作用的lncRNAs0610009E02Rik、Gm14207及AL645527.1，进一步研究发现这些lncRNAs与Notch1、Dl14及Hes7具有显著相关性。5、同源性分析表明lncRNAs0610009E02Rik与Notch1具有同源性。
　　结论:1.照射及HSCT共同作用，损伤肝窦内皮和肝细胞、破坏肝功能，致细胞因子分泌紊乱，引起肝细胞不可逆性损伤;2.Notch1信号通路参与移植后受损肝细胞的修复;3.lncRNA0610009E02Rik是Notch1的正性调节子，参与移植后HVOD受损肝细胞的修复。

目录

研究生个人简介

缩略词表

摘要

前言

第一部分 Notch1信号途径在异基因骨髓移植-肝静脉闭塞病损伤肝细胞修复中的作用研究

材料和方法

1 材料

2 方法

3 统计学处理

结果

第二部分 肝细胞基因芯片制作及结果分析，筛选与Notch1信号通路相互作用lncRNAs并初步验证

材料与方法

1 材料

2 方法

3 统计学分析

结果

讨论

结论

参考文献

综述 长链非编码RNA在人类肿瘤及其他疾病方面的研究进展

攻读硕士学位期间发表学术论文

临床培训小结

致谢

声明

论文审阅认定书