昆虫杆状病毒液化家蚕宿主组织的机制研究

摘要

杆状病毒感染昆虫后会造成虫体的液化现象,这有利于病毒向周围环境扩散。家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)对家蚕的感染也证实了这一观点,而苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒(Autographa california multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)感染家蚕后不会造成宿主组织的液化。虫体液化主要是由杆状病毒编码的组织蛋白酶(V-CATH)和几丁质酶(V-CHIA)活性造成的。
　　为了调查AcMNPV不液化家蚕宿主组织的原因,首先利用大肠杆菌表达系统大量表达AcMNPV-CATH和BmNPV-CATH、AcMNPV-CHIA和BmNPV-CHIA,并利用Ni-NTA柱亲和层析技术对两组酶蛋白进行纯化。结果显示,两组酶蛋白均能在大肠杆菌 BL21(DE3)plysS菌株中正确表达,但表达产物主要是以包涵体形式存在,而且与Ni-NTA柱结合较差;改用Ni-NTA柱变性亲和纯化和复性处理后,得到较高纯度的可溶性 V-CATH,但仍未能得到 V-CHIA。分别比较两组酶蛋白的活性,发现BmNPV-CATH活性纯化前较AcMNPV-CATH低27％,纯化后较AcMNPV-CATH低2％;BmNPV-CHIA活性与 AcMNPV-CHIA没有明显差异。上述结果说明,家蚕感染AcMNPV后不出现液化现象可能不是AcMNPV v-cath和v-chiA基因序列与BmNPV v-cath和v-chiA基因序列差异所造成的。
　　其次,利用Bac-to-Bac系统将 BmNPV的v-cath(Bmcath)、v-chiA(BmchiA)同时或分别重组到AcMNPV的极晚期强启动子Pp10和Ppolh下游,并以同样的方法将AcMNPV自身v-cath(Accath)、v-chiA(AcchiA)同时或分别重组到AcMNPV上,从而构建6种重组AcMNPV。结果显示6种重组AcMNPV均能感染家蚕,并造成家蚕宿主组织的液化,说明重组AcMNPV中v-cath和v-chiA的过量表达在病毒对家蚕组织液化过程中发挥了重要作用。对感染6种重组AcMNPV之间的蚕体液化发生时间和液化率进行比较,结果显示相对于 v-chiA,v-cath对组织液化的作用可能更加直接。对AcMNPV和重组AcMNPV感染家蚕血淋巴中的组织蛋白酶和几丁质酶活性测定,结果表明组织蛋白酶和几丁质酶活性分别随v-cath和v-chiA基因拷贝数的增加而增加。AcMNPV感染后不能液化家蚕宿主组织可能是由于病毒的组织蛋白酶活性太低,不足以液化宿主组织。
　　进一步调查了重组AcMNPV和BmNPV感染培养细胞和家蚕成体后对EGFP蛋白的降解情况。Western blot检测结果显示,重组BmNPV感染家蚕成体会造成EGFP蛋白的降解,而且该现象不因感染家蚕品种的改变而改变,可能是一种普遍现象。然而在重组BmNPV感染的BmN细胞以及重组AcMNPV感染的Sf21细胞和家蚕成体中,均未检测到EGFP蛋白的降解。利用EGFP-His融合蛋白的体外降解实验对EGFP蛋白的降解程度进行分析,结果显示EGFP蛋白的降解发生在距C末端约2 kDa的位置。对感染重组AcMNPV和重组BmNPV的家蚕血淋巴中的V-CATH活性进行测定,发现V-CATH活性是造成EGFP蛋白降解的主要原因。V-CATH活性和体外降解实验均表明,重组BmNPV感染的家蚕血淋巴中的V-CATH在感染后期具有很高的活性,它造成EGFP蛋白降解;重组AcMNPV感染的家蚕血淋巴中的V-CATH可能是以无活性形式积累的或活性很低,即使在感染后期也不会造成EGFP蛋白的降解的原因。
　　AcMNPV感染家蚕后具有不液化家蚕宿主组织和不降解所表达外源蛋白的特点, AcMNPV-家蚕表达系统用作一种进行家蚕成体水平基因功能验证的载体工具已得到广泛应用,而本研究从解析杆状病毒和宿主液化以及外源蛋白降解方面为AcMNPV系统的可行性提供了证据。

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Contents

第1章 绪 论

1.1 研究背景和选题意义

1.2 本文的主要内容

第2章 昆虫杆状病毒组织蛋白酶和几丁质酶的原核表达

2.1引言

2.2材料与方法

2.3结果与分析

2.4讨论

2.5本章小结

第3章 重组AcMNPV感染家蚕后造成组织液化的机制分析

3.1引言

3.2材料与方法

3.3结果与分析

3.4讨论

3.5本章小结

第4章 重组杆状病毒感染家蚕后造成外源蛋白的降解分析

4.1引言

4.2材料与方法

4.3结果与分析

4.4讨论

4.5本章小结

结 论

参考文献

附录 两种病毒组织蛋白酶和几丁质酶的氨基酸序列比对分析

攻读学位期间发表的学术论文

致谢