桑树青枯病病原菌的分离鉴定及其活体检测方法的建立

摘要

由青枯菌5号生理小种（Ralstonia solanacearumrace5）引起的桑青枯病是我国一种毁灭性的作物病害。由于缺乏有效的防控措施，因此早期诊断、尽早防控是控制该病害爆发流行的重要手段。本研究通过对采自广东发病桑园病树根部组织的病原菌进行分离鉴定、致病性测试分离到一株致病力的青枯菌株 RS-5。通过设计的青枯菌5号小种特异性引物设计了荧光定量PCR方法，可有效检测青枯5号小种菌株。通过使用叠氮溴化丙锭（PMA）对菌株预处理，建立了青枯菌5号小种的活菌检测方法。
　　从感染青枯病的桑树根部组织中分离到了3株具有典型青枯菌形态的桑青枯病病原菌RS-5，JX-3，GD-3，使用伤根接种法结合灌根接种法对三株菌进行致病性验证，其中RS-5可引发桑树产生青枯症状。对从发病桑苗中重新分离到的病原菌进行了培养形态观察和16S rDNA分子生物学鉴定，该菌与R. solanacearum的同源相似性高达99％，因而将此菌鉴定为青枯菌。
　　通过青枯菌5号小种与其他小种青枯菌的差异片段，筛选到了一对适宜的青枯5号小种特异性引物RS-72F/RS-312R，经过电泳验证和片段回收测序，验证该引物可特异性的扩增青枯菌5号小种DNA上241 bp的特异性片段，而对于其他小种青枯菌和土壤中其他种属的微生物均没有扩增。普通PCR对青枯菌5号小种全基因组DNA的检测限为50 pg/μL，对青枯菌5号小种菌液的检测限为1.0×104 CFU/ml。以青枯菌5号小种全基因组DNA和青枯菌5号小种菌液为模板进行荧光定量PCR检测，在10-4~102ng/μL范围内，DNA浓度与Ct值呈现良好的线性关系，线性方程为y=?2.747x+21.834(R2=0.993)，在103~107 CFU/mL范围内，菌液浓度与Ct值呈现良好的线性关系，线性方程为y=?3.418x+45.447(R2=0.998)。
　　利用叠氮溴化丙锭（PMA）对细菌样本进行预处理，使用15 ng/μL浓度的PMA，暗孵育10min，强光曝光5 min，可完全抑制107CFU/mL死菌中的DNA，且不会对活菌DNA的扩增造成影响，在103~107 CFU/mL范围内，PMA-qPCR的Ct值与菌浓的对数呈良好的线性关系，线性方程为y=-3.477x+47.489,R2=0.997。该方法能从活死菌混合体系中有效分辨出活菌。
　　本研究首次建立了桑树青枯病病原菌青枯菌5号小种的活菌检测方法，为青枯病的早期检测和防控提供了一种新的技术支持，对于减少青枯病造成的损失和保障蚕桑行业可持续发展具有重要的现实意义。

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第1章 绪论

1.1 前言

1.2 青枯菌概述

1.3 桑树青枯病概述

1.4 青枯菌检测研究进展

1.5 PMA用于活菌检测技术概论

1.6 本课题的研究意义和主要内容

第2章 桑青枯病病原菌的分离、鉴定

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

2.5 本章小结

第3章 桑青枯菌特异性检测引物的设计及qPCR方法的建立

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5本章小结

第4章 基于PMA-qPCR的青枯菌5号小种活体检测技术的建立

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

4.5 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢