DART-MS法快速测定桑叶中的DNJ含量及对环状多羟基化合物的电离行为研究

摘要

1-脱氧野尻霉素（DNJ）是一种多羟基哌啶类生物碱，具有降血糖、抗病毒、抗肿瘤等生物活性。桑叶作为 DNJ的一种主要天然植物来源，对桑叶中 DNJ的检测分析已有不少研究者报道。直接实时分析电离源（DART）是近些年发明出来的一种新型非表面接触型热解析大气压电离源，这种离子源具有操作简便，可以对样品进行直接、无损、快速、原位分析等特点。本文首次利用实时直接分析离子源串联三重四级杆质谱（RT-QqQ-MS/MS）对桑叶中的DNJ进行了定量分析并鉴定了桑叶中一些其他化学成分。环状多羟基化合物（CPHC）是一种广泛存在于生物体内的物质，例如糖类，黄酮类，生物碱类等。本文利用DART-MS/MS研究了CPHC在DART-MS正离子模式下的电离行为，该实验不仅为研究 CPHC提供了一条思路，而且可以为更深入全面的研究物质在DART源下的电离机理提供实验依据。本文研究内容如下：
　　1.建立一种利用DART-QqQ-MS/MS对桑叶中DNJ进行定性定量分析的方法。在DART-MS正离子模式下，DNJ主要形成两种离子[M+H]+(m/z164)和[M-2H+H]+(m/z162)；在DART-MS负离子模式下，DNJ形成的离子很复杂，且强度比正离子模式下要低得多，因此定量分析选择在正离子模式进行，离子m/z164和m/z162作为定量离子，两者强度之和作为DNJ的响应强度。借助二级质谱以及标准物质的帮助，鉴定了桑叶中另一种多羟基哌啶类生物碱—荞麦碱以及桑叶中的六碳糖。在1.01-40.50μg/mL DNJ标准溶液浓度范围内，实验所得线性回归曲线为y=12473581x-8612410，R2=0.996；对其中一样品进行加标回收率试验，回收率为87.73-95.61％；确定了该方法的检测限和定量限分别为0.25μg/mL，0.80μg/mL。将DART-MS法所测得的样品定量数据与经典的用于定量分析桑叶中 DNJ方法—柱前衍生高效液相色谱荧光检测法（HPLC-FLD）测定的数据做对比，两组数据的吻合度令人满意，说明DART-MS法是一种有效，准确的可用于定量桑叶中DNJ的分析方法。这种方法的建立可为快速筛选具有高含量DNJ的桑叶品种提供方法基础。
　　2.研究了20种CPHCs在DART-MS正离子模式下用He以及N2作为解吸气体的电离行为。分析结果表明，氧杂环和脂环的多羟基化合物电离主要形成离子[M+NH4]+；含氮和氮杂环的多羟基化合物电离主要形成离子[M+H]+。解吸气体不同，化合物产生的谱图也有所不同，当以 N2作为解吸气体时，绝大数物质谱图中可以观察到氧化脱2H离子[M-2H+NH4]+或[M-2H+H]+，而用He作为解吸气体时CPHC几乎不产生这种离子。此外，有些化合物在使用N2作为解吸气体时，还会形成离子[M+nO+NH4]+(n=1,2)或[M+nO+H]+(n=1)，这种类型离子的形成与化合物具体的结构有关。
　　3.为了深入探究3类结构的环状多羟基化合物在DART-MS正离子模式下的离子化倾向，运用量化计算对化合物的电离过程进行了模拟。实验中葡萄糖，肌醇和DNJ被选择作为各自结构类型CPHC的反应分子，将这3个分子分别与NH4+和 H+反应，优化得到了反应产物离子的稳定构型。模拟结果表明，葡萄糖分子能够通过氢键相互作用与NH4+结合，此外葡萄糖与H+反应产物的稳定构型也被优化得到，稳定结构中，H+很难与葡萄糖分子中的-OH结合而易与环上的O原子结合，而这个反应得到的离子[glucose+H]+在实验中并没有观测到，这个现象有待从这个反应的动力学上去解释；肌醇与H+的反应很难发生而与NH4+的反应容易发生，肌醇分子与NH4+也是通过氢键作用结合的；DNJ与H+以及NH4+反应的稳定产物通过优化均被得到，这跟实际的实验结果不同，在实际结果中只能观察到[DNJ+H]+离子而观察不到[DNJ+NH4]+离子，造成这一现象的原因可能包括两个方面：1.从反应热力学的角度，DNJ与H+反应要比DNJ与NH4+反应放热剧烈，因此前者反应更易发生；2.从反应动力学的角度，推测可能是由于DNJ与H+反应的反应能垒要远低于DNJ与NH4+反应的反应能垒，由于前者反应能垒很低因此更易进行。综合上述理由，DNJ更倾向于与H+发生反应。

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第1章 绪 论

1.1引言

1.2 1-脱氧野尻霉素的研究进展

1.2.1 DNJ的来源

1.2.2 DNJ的生物活性

1.2.3 桑叶中DNJ的提取

1.2.4 桑叶中DNJ的分析与检测

1.3实时直接分析电离源（Direct analysis in real timeDART）的研究进展

1.3.1 DART离子源的构造以及工作原理

1.3.2影响DART源对物质分析的参数

1.3.3 DART源的电离机理

1.3.4 DART-MS应用研究进展

1.4 本文的主要研究内容

第2章 实时直接分析质谱法测定桑叶中的1-脱氧野尻霉素

2.1 引言

2.2实验部分

2.2.1 实验材料

2.2.2 实验试剂与仪器

2.2.3 样品与试剂的制备

2.2.4 仪器条件

2.3结果与分析

2.3.1 HPLC-FLD法中流动相的优化

2.3.2 DNJ在DART-MS下的质谱行为

2.3.3 DART离子源参数的优化

2.3.4桑叶提取物DART-MS谱图的指认

2.3.5基质效应对DART-MS定量桑叶提取物中DNJ的影响

2.3.6对比HPLC-FLD法与DART-MS法测定桑叶提取物中的DNJ含量

2.4 本章小结

第3章 环状多羟基化合物在DART-MS正离子模式下的电离行为研究

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 实验试剂

3.2.2 仪器

3.2.3 DART-MS实验研究

3.2.4 量化计算

3.3结果与讨论

3.3.1 20种环状多羟基化合物的DART-MS电离行为

3.3.2 量化计算研究3类环状多羟基化合物的DART-MS电离行为

3.4 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的论文

致谢