家蚕体壁Spatzle5基因参与真菌与革兰氏阳性菌感染的Toll信号通路

摘要

昆虫是地球上种类最多的动物群体。与脊椎动物不同，昆虫没有获得性免疫，只能依靠自身的天然免疫抵御外界微生物的入侵。天然免疫是机体的第一道防线。微生物入侵时，一组种系编码的模式识别受体可以识别并结合到保守的病原体相关分子模式上，通过一系列的信号传导产生抗菌肽最终消灭微生物。Toll信号通路是目前研究最多的一条信号通路，昆虫Spatzle(spz)在Toll信号通路中发挥重要作用。本实验通过克隆家蚕Spatzle5（Bmspz5）基因、生物信息学分析、组织特异性表达、微生物诱导表达、RNA干扰等一系列实验来研究Bmspz5基因的特性和参与的Toll信号通路。具体的实验内容如下：
　　本实验成功克隆出Bmspz5的ORF和3’非编码区，该基因位于7号染色体上，在基因组中只有1个拷贝，共有6个外显子，5个内含子，外显子/内含子边界处均符合GT-AG规则。该基因共编码405个氨基酸，通过序列比对发现其C末端比家蚕基因组数据库预测的ORF多出56个氨基酸。蛋白质分子质量为45.93 kD，等电点为8.96，为胞外蛋白，疏水区和亲水区域交错排列。生物信息学分析发现Bmspz5与果蝇和烟草天蛾的亲缘关系较近，并含有相同的七个保守的半胱氨酸结构域。
　　半定量RT-PCR分析Bmspz5的组织表达情况，结果表明，Bmspz5基因在家蚕五龄三天幼虫各组织中的表达量都不相同，其中在头部中的表达量最高，在皮肤中的表达量相对较高，而在其他组织当中几乎都没有表达。微生物诱导实验结果表明，注射酵母菌和枯草芽孢杆菌能够引起 Bmspz5基因在表皮中的表达量上调，而注射大肠杆菌则不能影响 Bmspz5基因在表皮中的表达量，而在头中，注射酵母菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌均不能引起Bmspz5基因的表达量上调。因此，可以推断Bmspz5基因参与了体壁中家蚕抵御真菌和革兰氏阳性菌入侵的免疫应答反应。
　　RNA干扰实验表明，体壁中酵母菌感染后，Bmspz5基因的沉默能够明显抑制转录因子Cactus、Rel和抗菌肽Attain、Moricn和Gloverin的表达；注射芽孢杆菌时，也有类似的结果，但是抑制效率没有酵母菌的高。由此可见，Bmspz5基因沉默可以抑制抗菌肽Attain、Gloverin、Moricn和Toll通路中的转录因子Cactus、Rel的表达，而不能抑制IMD通路中转录因子Relish的表达。结果表明，Bmspz5基因参与家蚕体壁中Toll信号通路的免疫应答。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

第1章 绪论

1.1 研究背景

1.2研究现状

1.3研究内容

1.4研究意义

第2章 Bmspz5基因的克隆和结构分析

2.1 引言

2.2 材料和方法

2.3 实验结果

2.4 本章小结

第3章 Bmspz5基因的功能研究

3.1 引言

3.2 材料和方法

3.3 实验结果

3.4 本章小结

第4章 Bmspz5基因干扰的研究

4.1 引言

4.2 材料和方法

4.3 实验结果

4.4 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表及待发表的学术论文

致谢