桑树硬枝扦插生根的生理生化与分子机理研究

摘要

扦插育苗因方法简单、周期短、是木本植物无性繁殖的重要手段。桑树属于扦插生根较难的树种，通过常规扦插方法繁育的桑苗根系数量少，生根部位主要是位于桑芽的两边和下方根原基和切口的愈伤组织，移栽不易成活，故扦插技术一直未能在桑苗繁育上大规模应用。诱导插穗皮部生根扦插技术是近年来本课题组研究的一种高效的育苗方法。利用该技术，可使插穗生根率达90％以上，株平均生根量达30条以上，生根形式表现为高效的皮部生根，效果明显的优于愈伤组织生根的传统扦插技术。
　　本研究就是基于上述技术，采用植物生理、转录组、蛋白质组等研究的相关方法和技术，从生理水平、转录组水平和蛋白质组水平全面地对其生根机理进行研究，并对其生根机制进行探讨，以期为植物扦插育苗技术的创新提供理论参考。主要取得了以下研究结果：
　　1、采用育71-1一年生硬枝为插穗，以清水处理为对照，测定了愈伤组织和皮部生根两种类型生根过程中可溶性总糖、可溶性蛋白、酚含量和吲哚乙酸氧化酶(IAAO)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)活性，并进行比较分析。结果表明：不同生根类型中，各生理指标呈现出不同的特性和变化规律。可溶性糖和可溶性蛋白含量在对照和愈伤组织生根中一直呈下降趋势，在皮部生根中则表现为先下降再升高。IAAO活性在皮部生根中经过一个短暂的下降后迅速升高，在愈伤组织生根中则保持一段时间的稳定后开始下降；POD和PPO活性在愈伤组织生根和皮部生根生根过程中变化趋势相同，都是先上升后下降，但皮部生根中的活性高于愈伤组织生根。酚类物质含量在皮部生根中一直下降，而在愈伤组织生根中则下降一段时间后开始上升。
　　2、通过对桑树硬枝扦插皮部生根的3个发育时期（正常期—Stage1、基部膨大期—Stage2、发根期—Stage3）进行转录组测序及序列分析，各个发育时期分别鉴定到18729、19044和19987个基因。在Stage2/Stage1中，鉴定到8930个差异表达基因，Stage3/Stage1中，鉴定到9135个差异基因，Stage3/ Stage2中，差异表达基因较少，为2739个。通过对差异表达基因进行GO功能注释和KEGG数据库比对分析，这些差异基因在扦插生根中主要执行代谢过程、定位系统建立、再生过程、生物调控、细胞组分、细胞器组分、大分子复合物、结合剂活性等功能。主要参与植物-病原菌互作、植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢、苯丙素生物合成、类黄酮生物合成等代谢途径。
　　3、通过对转录组测序的3个材料进行蛋白质组比较分析。在3个发育时期共鉴定到4427个蛋白，其中2875个蛋白被定量。Stage2/ Stage1的差异蛋白质有595个，Stage3/ Stage1的差异蛋白质有660个，Stage3/ Stage2的差异蛋白质有231个。从差异表达显著的蛋白质中筛选出生长素IAA水解酶、热激蛋白hsp70、凝集素KM+、细胞色素b6、过氧化物酶等可能与生根过程密切相关的蛋白质。通过与GO和KEGG数据库比对注释，这些差异蛋白质在扦插生根中主要执行的功能包括代谢过程、定位系统建立、生物调控、刺激应答、细胞要素、催化活性和蛋白绑定等功能；并主要参与次生代谢产物的生物合成、淀粉和蔗糖代谢、内质网蛋白加工、苯丙素生物合成、糖酵解和糖异生等代谢通路。
　　4、通过对转录组测序结果和蛋白质组分析结果进行关联分析，从变化趋势相同的差异基因、蛋白中挑选出PPO1、PPO2、PPO3、ILL5、GH3.1、HSP83A、Cacybp、ANT1、SAUR2等9个基因，并通过qRT-PCR技术检测这些基因在愈伤组织生根和皮部生根两种生根形式生根过程中的表达变化。结果显示各个基因在扦插生根中均表现出相应的表达特性，并通过不同的作用机制调控不定根形成。同时对3个PPO基因的CDS序列进行了克隆和序列分析，将结果上传Genebank数据库，序列号分别为KT371991、KT371992和KT371993。
　　本研究从桑树硬枝扦插两种不同生根形式生根过程相关生理指标和9个重要相关基因表达量的变化，并结合皮部生根过程基部皮层的转录组学和蛋白质组学分析结果，证实了扦插生根是一个由外源环境和内源物质等多因素共同调控的一个复杂的、动态的过程。不同的处理方法、培养条件等都会导致不同的生根效果。在整个不定根形成的过程中，从生理生化物质到调控基因、蛋白等都发挥了重要的作用。包括起防御和保护作用的相关酶类、调控基因，激素调控的相关基因、蛋白，细胞增殖和能量代谢相关的生理物质等。各调控基因和生理物质相互作用、共同完成不定根形成和发育的调控。研究结果为进一步开发高效实用的桑树扦插技术奠定了良好的理论基础。
　　本论文尽管从不同层面对桑树硬枝扦插生根的机理进行了研究，且取得了一些成果，但也仅是对扦插生根机理探索的冰山一角，有待于对其进行更深入的研究。

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第1章 绪 论

1.1选题的背景与目的意义

1.2 桑树的概述

1.3 植物扦插生根机理研究进展

1.4 转录组测序技术及应用

1.5 蛋白质组学研究技术及应用

1.6 研究内容与技术路线

第2章 桑树硬枝扦插生根的生理生化特性研究

2.1材料与方法

2.2结果与分析

2.3 讨论

第3章 桑树硬枝扦插皮部生根过程基部皮层的转录组分析

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

第4章 桑树硬枝扦插皮部生根过程基部皮层的蛋白质组分析

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

第5章 桑树硬枝扦插生根过程相关功能基因的筛选及功能分析

5.1 材料和方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论

第6章 3个PPO基因的克隆及生物信息学分析

6.1 实验方法

6.2 结果与分析

6.3 讨论

结论

参考文献

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