家蚕nanos的鉴定以及Nanos和Vasa在家蚕幼虫性腺中的免疫组化分析

摘要

Nanos基因自从在果蝇中发现之后，陆续在其他昆虫、线虫、爪蟾、斑马鱼乃至高等哺乳动物中发现其同源基因。Nanos基因编码一个锌指结构蛋白，常作为基因表达的调控因子。它是原始生殖细胞的迁移和分化，以及生殖细胞的维持所必需的。探讨这一基因在配子发生过程中的表达和功能具有重要意义。 本研究中运用RACE技术和生物信息学的方法克隆了一条家蚕nanos基因全长cDNA序列，并运用相关的生物信息学软件对其进行了分析。结果表明，家蚕nanos基因全长为1913 bp，含有7个外显子和6个内含子，开放阅读框(ORF)长954 bp，编码317个氨基酸，相对分子质量为35 kD，等电点为5.38，并且有一个保守的Nanos RNA结合结构域。序列已经提交到NCBI数据库(GenBank no：EF647589)。 根据这一cDNA序列设计引物扩增出了其一个编码序列，并在大肠杆菌中进行了表达，得到了分子量约33 kD的融合蛋白，蛋白经纯化回收后免疫新西兰大白兔，收集抗血清。对家蚕早期胚胎蛋白以及不同家蚕组织蛋白的Western blot检测表明，Nanos在家蚕早期胚胎中基本是恒定表达，并且在几乎家蚕幼虫的所有组织中都有表达。对家蚕胚胎的荧光定量PCR检测显示，刚产的卵中nanos的表达量最大，第二天开始急剧下降，此后到第十天表达量几乎没有变化。 对家蚕幼虫性腺的免疫组化结果显示，在卵巢中，Nanos蛋白在不同发育时期的卵母细胞中都有表达。在家蚕的精巢中，Nanos蛋白在精原细胞中的表达量较大，晚期精母细胞中的表达量很少，几乎不表达。同时以抗家蚕Vasa蛋白的抗血清对家蚕幼虫性腺进行免疫组化检测显示了和Nanos相似的分布模式，主要分布于不同发育时期的性细胞(精原细胞，精母细胞，卵母细胞等)中。 Nanos蛋白分布于很多家蚕组织，提示这一基因表达的调控因子在很多组织中都起作用，有着功能的广泛性。Vasa和Nanos在家蚕精子发生早期发挥着重要作用；而在卵子发生中主要作为遗传信息储备物质，用于调控早期胚胎发育过程中原始生殖细胞的形成与分化。Vasa和Nanos不仅在维持雌雄生殖干细胞一卵原细胞及精原细胞的自我更新和正常功能方面起着重要作用，而且是精子形成所不可缺少的。

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第一章绪论

1.1生殖细胞的发生

1.2与生殖细胞发生相关的基因

1.2.1 gcl基因的表达及功能

1.2.2 nanos基因的表达及功能

1.2.3 vasa基因的表达及功能

1.2.4 Pumilio基因相关研究

1.3相关实验技术介绍

1.3.1免疫组织化学

1.3.2荧光定量PCR技术

1.4本研究的目的和意义

1.5主要研究内容和技术路线

1.5.1主要研究内容

1.5.2技术路线

第二章家蚕nanos基因的克隆鉴定及生物信息学分析

2.1材料和试剂

2.2方法

2.2.1 5'RACE

2.2.2家蚕nanos基因的分析

2.3结果与分析

2.3.1家蚕nanos基因的5'RACE及全长序列

2.3.2 Bm-nanos mRNA 3’非翻译区的二级结构预测

2.3.3 Bm-nanos的基因结构分析

2.3.5 Bm-nanos蛋白的保守性分析及系统发育树的构建

2.4讨论与总结

第三章 Bm-nanos基因的原核表达及抗体制备

3.1材料和试剂

3.1.1质粒和菌株

3.1.2试剂及酶

3.1.3试剂的配制

3.1.4一些必要的仪器

3.2实验方法

3.2.1家蚕卵巢总RNA提取及反转录PCR

3.2.2 Bm-nanos基因的PCR扩增

3.2.3 Bm-nanos基因表达载体的构建

3.2.4 Bm-nanos基因在大肠杆菌中的表达

3.2.5 Western印迹

3.2.6 Bm-nanos融合表达产物的纯化

3.2.7多克隆抗体的制备及纯化

3.3结果与分析

3.4讨论与总结

第四章 Bm-nanos基因的表达分析

4.1材料和试剂

4.2实验方法

4.2.1 Bm-nanos基因在家蚕不同发育时期胚胎中的表达分析

4.2.2 Bm-nanos基因在不同家蚕组织以及早期胚胎发育中的表达分析

4.3结果与分析

4.3.1 Bm-nanos在家蚕胚胎不同发育时期的荧光定量PCR结果

4.3.2 Bm-nanos在家蚕早期胚胎以及不同家蚕组织中的检测

4.4讨论与总结

第五章家蚕幼虫性腺组织Nanos和Vasa的免疫组化分析

5.1材料和试剂

5.2实验方法

5.2.1组织获得及冰冻切片

5.2.3免疫组化分析

5.3结果与分析

5.3.1 Vasa和Nanos在家蚕幼虫卵巢中的免疫组化分析

5.3.2 Vasa和Nanos在家蚕幼虫精巢中的免疫组化分析

5.4讨论与总结

5.4.1 vasa基因的表达及生殖细胞发生中的功能分析

5.4.2 nanos基因的表达及其在配子发生中的作用

第六章总结与展望

6.1主要工作总结

6.2工作展望

参考文献

致谢

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参加课题