一个新的油菜转化体系的优化和血红蛋白基因SLR2097向甘蓝型油菜中的转化

摘要

甘蓝型油菜(Brassica napus)是重要的经济作物之一。传统常规育种技术在油菜重要经济性状的遗传改良中起到重要作用，但随着生产需求对品种要求的日益提高，常规育种技术的局限性也日显突出。因此采用新技术将新的基因资源引入油菜十分必要。利用农杆菌介导的遗传转化引入外源基因为油菜产量、品质、抗性和其它性状的遗传改良提供了新途径，该技术也是现代生物学研究中了解特定基因功能与表达模式不可缺少的手段。但现有农杆菌介导的油菜转化方法还存在着转化效率不高、重复性差、转化周期长等问题，因而限制了该技术的广泛应用。因此，建立一个转化效率高、重复性好、转化周期短的油菜转化体系是势在必行的。
　　 血红蛋白(Hemoglobin)普遍存在于动物、植物、细菌、真菌、酵母、藻类、原生动物等生物体中。血红蛋白在动物体中的生理功能主要是结合氧并协助其运输，从而促进机体中氧的供应、呼吸链电子流量、ATP酶活力等；血红蛋白在微生物体中可以促进菌体的生长、蛋白质的合成、代谢产物的产生等；最近，也有文章报道血红蛋白能促进烟草的生长、提高烟草叶中叶绿素与尼古丁的含量等。
　　 本研究旨在用农杆菌(Agrobacterium tumefactiens)介导的转化方法，以甘蓝型油菜品种宁油12号的子叶节为外植体，优化一个转化周期短、重复性好的遗传转化体系。从而用优化了的遗传转化体系，将血红蛋白基因(SLR2097)导入油菜中，研究血红蛋白对油菜的影响。主要研究内容和结论如下：
　　 ⑴用含有携带GFP基因的植物双元表达载体pCAMBIA1303的农杆菌来侵染甘蓝型油菜品种宁油12号的子叶节外植体，从而优化油菜的遗传转化体系。实验结果显示，在含有浓度为4 mg/L的6-BA与0.04 mg/L的NAA的筛选培养基中获得了最高的小芽发育率为94.38％；而当用含有浓度为200μM的乙酰丁香酮与0.02％的silwet L77，OD值为0.8的农杆菌悬浮液来侵染油菜的子叶节10 min并在含有浓度为200μM的乙酰丁香酮与0.02％的silwet L77的培养基中共培养时，获得了最高的转化率为6.96％；转基因植株是用PCR技术、Southem blotting分析来鉴定的；在荧光显微镜下也观察到了转基因植株中的GFP基因的表达。
　　 ⑵文献表明血红蛋白能促进烟草的生长、提高烟草叶中叶绿素与尼古丁的含量。本研究以蓝细菌(Synechocystis sp.PCC6803)为材料，采用PCR技术从蓝细菌的基因组DNA中克隆了SLR2097基因的ORF，此ORF全长375 bp，编码一个由123个氨基酸残基组成的多肽链，推测其编码的多肽链的相对分子质量为30.39kD，理论等电点为5.26。比较蓝细菌的SLR2097与其它13种生物的血红蛋白基因编码的氨基酸序列发现，这些生物的SLR2097基因编码的氨基酸序列的保守性非常低，除了有一个共同的基序F-[LF]-x(4)-[G]-G-[PAT]-x(2)-[YW]-x-[GSE]-x(1，5)-[LW]-x(3)-H之外，几乎再没有共同的序列。
　　 ⑶构建携带35S启动子的植物双元表达载体pCAMBIA1300-CaMV35S。并将SLR2097基因连入此表达载体上，转化农杆菌菌株LBA4404。然后，利用优化了的遗传转化体系，将SLR2097基因导入甘蓝型油菜中。用10mg/L与20mg/L的潮霉素来筛选转基因植株，并用PCR技术鉴定转基因植株。从观察结果来看，转基因油菜比野生型油菜要早熟。

目录

文摘

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论文说明：缩写词表

声明

第一章绪论

1.1植物转基因技术

1.1.1植物基因转化体系

1.1.2根癌农杆菌介导的植物基因转化

1.1.3外源基因在转化体中的遗传学行为

1.2油菜的基因转化研究

1.2.1油菜基因转化方法

1.2.2外源基因在转化油菜植株中的遗传表达

1.3遗传转化在油菜遗传改良中的应用

1.3.1 菜籽的品质改良

1.3.2油菜抗逆性遗传改良

1.3.3油菜雄性不育的遗传改良

1.3.4利用转基因油菜生产生物可降解塑料成分和药用产品

1.3.5油菜的抗衰老遗传改良

1.4转基因油菜的生态安全性评价

1.5血红蛋白

1.5.1 透明颤菌血红蛋白的生理功能

1.5.2透明颤菌血红蛋白在转基因烟草中的表达

1.5.3 具有两个结构域的血红蛋白-黄素血红蛋白(FHP)

1.6本研究的目的和意义

1.7主要研究内容和技术路线

1.7.1主要研究内容

1.7.2技术路线

第二章一个新的甘蓝型油菜转化体系的建立

2.1材料和方法

2.1.1植物材料

2.1.2菌种与试剂

2.1.3农杆菌与植物培养基

2.1.4主要仪器设备

2.1.5实验所用的培养基

2.1.6不同浓度的6-BA与NAA对宁油12号子叶节外植体芽再生的影响

2.1.7不同农杆菌菌液浓度与侵染时间对转化效率的影响

2.1.8不同浓度的乙酰丁香酮与silwet L77对转化效率的影响

2.1.9转基因植株的分子检测

2.1.10 GFP基因在油菜植株中的表达

2.2结果与分析

2.2.1 6-BA与NAA对子叶节发育成绿色小植株的影响

2.2.2农杆菌浓度与侵染时间对转化效率的影响

2.2.3 乙酰丁香酮与silwet L77对转化效率的影响

2.2.4转基因植株的PCR检测

2.2.5转基因植株的Southern blotting检测

2.2.6 GFP基因在转基因油菜中的表达

2.3讨论

2.4本章总结

第三章SLR2097基因的克隆与序列分析

3.1材料和方法

3.1.1微生物材料

3.1.2试剂及酶

3.1.3蓝细菌SLR2097基因的克隆

3.2结果与分析

3.2.1 SLR2097基因的克隆

3.2.2蓝细菌SLR2097基因的序列分析

3.2.3蓝细菌与其它几种生物的血红蛋白的氨基酸序列的同源性比较

3.2.4蓝细菌的血红蛋白基因的分子进化分析

3.3本章总结

第四章蓝细菌SLR2097基因向油菜中的转化与表达

4.1材料与方法

4.1.1菌种、载体和试剂

4.1.2基本溶液的配制

4.1.3主要仪器设备

4.1.4 SDS-碱裂解法小量抽提质粒DNA

4.1.5大肠杆菌热击感受态的制备

4.1.6大肠杆菌感受态细胞的热击转化

4.1.7双元表达载体pCAMBIA1300-CaMV35S的构建

4.1.8 pCAMBIA1300-CaMV35S-SLR2097表达载体的构建

4.1.9农杆菌感受态细胞的制备

4.1.10重组质粒转化农杆菌感受态细胞

4.1.11 阳性克隆的鉴定和保存

4.1.12根癌农杆菌介导的油菜转化

4.1.13转基因油菜的PCR鉴定

4.2结果与分析

4.2.1 pCAMBIA1300-CaMV35S-SLR2097表达载体的构建

4.2.2重组质粒pCAMBIA1300-CaMV35S的酶切鉴定

4.2.3重组质粒pCAMBIA1300-CaMV35S-SLR2097的酶切鉴定

4.2.4重组质粒转化农杆菌的PCR鉴定

4.2.5转基因植株的PCR鉴定

4.2.6蓝细菌SLR2097基因对油菜的影响

4.3讨论

4.4本章总结

第五章总结与展望

5.1主要工作总结

5.2 工作展望

参考文献

致 谢

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