伤寒沙门菌RcsB负性调控鞭毛抗原基因fljB：z66的表达

摘要

目的：探讨调节因子RcsB对伤寒沙门菌H：z66鞭毛抗原编码基因fljB：z66表达的调节作用。 方法：采用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌的调节因子RcsB的基因缺陷变异株rcsB-，根据伤寒沙门菌rcsB基因序列设计引物，扩增rcsB基因上、下游同源性片段，定向连接成rcsB基因缺损型同源核苷酸片段，并与自杀质粒pGMB151相连后经电击法导入伤寒沙门菌野生株，进行同源重组，通过筛选获得rcsB-；采用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌的z66鞭毛抗原基因的β-半乳糖苷酶插入变异株fljB：lacZ，设计加接Kpn Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点的特异性引物，用PCR扩增获得fljB基因的上、下游同源性DNA片段，并与用Kpn Ⅰ和Sal Ⅰ酶切pSV-β-galactosidase vector的片段定向连接，并克隆至自杀质粒pGMB151的Barn HI，再通过电击法转入伤寒沙门菌野生株及rcsB-缺陷株，在含X-Gal的蔗糖平板上筛选获得同源重组变异株fljB：lacZ和rcsB-fljB：lacZ；分别在低渗(50mmol/L，NaCl)、高渗(300mmol/L NaCl)LB液体培养基中培养沙门菌野生菌株及rcsB-缺陷株，通过荧光实时定量RT-PCR观察力fljB：z66在不同渗透压条件下的mRNA水平；分别在低渗、高渗LB液体培养基中培养fljB：lacZ和rcsB-fljB：lacZ，通过测定β-半乳糖苷酶LacZ的活性来观察伤寒沙门菌在不同渗透压条件下fljB：z66翻译水平的表达。 结果：PCR及序列分析证实，rcsB变异株中rcsB基因372bp被14bp取代，表明成功构建rcsB缺陷株；PCR及序列分析证实变异株中fljB基因中的763bp被3550bp的lacZ片段替代，表明成功构建fljB：：lacZ和rcsB-fljB：：lacZ变异株；通过荧光实时定量RT-PCR测定，发现在高渗和低渗条件下rcsB缺陷株的mRNA水平表达比野生株显著增高；通过β-半乳糖苷酶测定，发现在高渗和低渗条件下rcsB缺陷株fljB：z666翻译水平的表达比野生株显著增高。 结论：成功构建伤寒沙门菌rcsB-，fljB：：lacZ和rcsB-fljB：：lacZ变异株，伤寒沙门菌调节因子RcsB在高渗和低渗条件下对力fljB：z66表达的均呈负性调控作用。

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文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写索引

声明

第一章绪论

1.1 伤寒沙门菌简介

1.2 沙门菌鞭毛基本结构

1.3 RcsC-RcsD-RcsB磷酸转移系统

1.4 Rcs系统对fljB:z66基因表达调节研究

第二章本论文研究的目的、方法、实验方案的设计

2.1研究目的

2.2研究方法及技术

2.3实验设计

第三章伤寒沙门菌rcsB缺陷株的构建及鉴定

3.1材料方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果

3.3讨论

第四章伤寒沙门菌fljB∷lacZ变异株的构建及鉴定

4.1材料方法

4.1.1材料

4.1.2方法

4.2结果

4.3讨论

第五章RcsB调节子对伤寒沙门菌fljB:z66转录水平的表达调节

5.1材料与方法

5.1.1材料

5.1.2方法

5.2结果

5.3讨论

第六章RcsB调节子对伤寒沙门菌fljB:z66抗原基因蛋白水平的调节

6.1材料方法

6.2结果

6.3讨论

第七章主要结论及展望

7.1主要结论

7.2展望

参考文献

致 谢

攻读硕士学位期间发表的文章及学术交流