伤寒沙门菌PhoP对鞭毛抗原基因fljB：z66的表达调节

摘要

目的：探讨调节因子PhoP对伤寒沙门菌H:z66鞭毛抗原编码基因fljB：z66在各种环境应激下的表达调节作用。 方法： 1. 采用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌phoP缺陷变异株。根据伤寒沙门菌phoP基因序列，设计PCR特异性引物，并在引物末端加上需要的酶切位点。扩增phoP基因上、下游片段，用BglⅡ消化后，定向连接成phoP基因的缺损性同源性核苷酸片段。将此片段胶回收后用后导入自杀质粒pGMB151的BamHⅠ酶切位点，将阳性质粒用电击法导入伤寒沙门菌野生株(GIFU 10007)，进行同源重组。用PCR观察重组现象，将完全重组的菌株作为phoP基因的缺陷变异株，并通过相应的核苷酸序列分析加以确定。 2.将laeZ基因作为鞭毛抗原基因fljB的报告基因，采用自杀质粒介导的同源重组方法制备fljB：：lacZ变异株，使菌株的β-半乳糖苷酶活性代表fljB基因的蛋白表达水平。通过电击法将含fljB：：lacZ的重组质粒转入野生型及phop-伤寒沙门菌，通过在含X-Gal的蔗糖平板上的显色筛选和PCR筛选获得同源重组的fljB：：lacZ和phoP fljB：：lacZ变异株，并通过相应的核苷酸序列分析加以确定。 3.对伤寒沙门菌的fljB：：lacZ和phoP fljB：：lacZ变异株同时进行高渗应激、氧应激、胆汁应激和弱酸应激，通过比较两者β-半乳糖苷酶活性的变化，研究在不同应激环境下调节因子PhoP是否对鞭毛抗原编码基因fljB：z66存在表达调节作用。 结果： 1.经PCR及序列分析证实变异株中phoP基因缺失了297个碱基，表明成功构建伤寒沙门菌phoP基因缺陷变异株。 2.经PCR、X-gal底物显色及序列分析证实，变异株中fljB基因中的763bp被3550bp的lacZ片段替代，表明伤寒沙门菌fljB：：lacZ和phoP-fljB：：lacZ变异株构建成功，可通过测定其β-半乳糖苷酶活性反映fljB翻译表达水平。 3.对比伤寒沙门菌的fljB：：lacZ和phoP-fljB：：lacZ变异株在高渗应激、氧应激、胆汁应激和弱酸应激下β-半乳糖苷酶活性变化的差异，结果显示，在低渗环境下，伤寒沙门菌的fljB：：lacZ变异株的β-半乳糖苷酶活性明显高于phoP-fljB：：lacZ变异株；在高渗应激后，fljB：：lacZ株中β-半乳糖苷酶活性呈从高到低的抑制性变化，而phoP-fljB：：lacZ株中的酶活性却无明显的动态变化。在氧应激、胆汁应激和弱酸应激时两者β-半乳糖苷酶活性变化无明显差异。 结论：在低渗环境下，伤寒沙门菌调节因子PhoP促进了鞭毛抗原编码基因fljB：z66的表达；在高渗应激下，PhoP可能参与了鞭毛抗原编码基因fljB：z66的表达下调作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1伤寒沙门菌的z66鞭毛抗原

1.2 PhoP-PhoQ双组分调节系统

1.2.1 Mg2+浓度对PhoP-PhoQ系统的调节

1.2.2 PhoP-PhoQ系统在酸性应激时的作用

1.2.3 PhoP-PhoQ系统在胆汁应激时的作用

1.2.4 PhoP-PhoQ系统调控对脂质A的结构修饰

1.2.5 PhoP-PhoQ系统调控对抗菌肽(AMPs)的抵抗力

1.3调节因子PhoP与z66鞭毛抗原表达可能的作用关系

第二章本论文研究的目的、方法、实验方案的设计

2.1研究目的

2.2研究方法及技术

2.3实验方案的设计

第三章伤寒沙门菌phoP缺陷株的构建及鉴定

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果

3.2.1 phop基因上、下游片段F1、F2的扩增

3.2.2 phoP基因缺陷性同源性核苷酸片段的制备

3.2.3重组自杀质粒pGMB151的构建及鉴定

3.2.4重组变异株的筛选及鉴定

3.2.5测序结果及比对

3.3讨论

第四章伤寒沙门菌fljB∷lacZ和phoP-fijB∷lacZ变异株的构建及鉴定

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2方法

4.2结果

4.2.1伤寒沙门菌fljB∷lacZ和phoP-fljB∷lacZ变异株的构建及鉴定

4.2.2细菌lacZ基因表达β-半乳糖苷酶活性测定方法的确定

4.3讨论

第五章 PhoP对鞭毛抗原基因fljb:z66的表达调节

5.1材料与方法

5.1.1材料

5.1.2方法

5.2结果

5.2.1渗透压应激

5.2.2氧应激

5.2.3胆汁应激

5.2.4弱酸应激

5.3讨论

第六章主要结论及展望

6.1主要结论

6.2展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的文章