解偶联蛋白2在肝细胞的表达及其与肝细胞脂肪变性关系的研究

摘要

目的：建立肝细胞脂肪变性的细胞模型，研究解偶联蛋白2在正常肝细胞及不同程度脂肪变的肝细胞中表达情况，探讨解偶联蛋白2与肝细胞脂肪变的关系及其对肝细胞能量代谢的影响。 方法：将正常人肝细胞株HL-7702作为实验对象，用脂肪乳剂(临床静脉营养药物)培养肝细胞，使其发生不同程度的脂肪变，作为肝细胞脂肪变的模型。正常培养的细胞作为对照组，另设四组为模型组，其培养液内脂肪乳剂的浓度分别为0.5μl/ml、1.0μl/ml、2.0μl/ml及3.0μl/ml。分别干预24小时、48小时、72小时后，检测细胞活力以及细胞受损的情况(培养液中ALT、AST泄漏量)，同时用油红O染色发生脂肪变的肝细胞，显示肝细胞内脂肪变的情况，并测定细胞内TG及ATP含量。应用RT—PCR技术检测细胞内UCP2mRNA表达水平，免役印迹检测UCP2蛋白的表达情况。 结果：脂肪乳剂培养细胞48小时之内各组ALT、AST水平较之正常对照组无明显差异(p＞0.05)，成功制备出NAFLD模型。油红O染色显示正常对照组则无明显脂滴堆积，而模型组肝细胞胞浆内出现大量脂滴，而且脂滴的量随着脂肪乳剂浓度的增加而不断增多。模型组细胞内甘油三脂(TG)含量明显高于正常组(p＜0.01)，细胞内的ATP含量随着脂肪的不断堆积而减少(p＜0.05)。正常肝细胞内可以检测到UCP2mRNA表达，且随着脂肪乳剂浓度的不断增加，UCP2mRNA表达量也增加。模型组与正常对照组表达量相比，差异具有显著性(P＜0.01)，模型组之间的表达量差异也具有统计学意义(P＜0.01)。正常组内未检测到UCP2蛋白，模型组中随着肝细胞脂肪变程度的加重，UCP2蛋白表达也增加(P＜0.05) 结论：应用脂肪乳剂在合理的浓度和干预时间段内培养肝细胞，可以运用体外培养的方法成功地制备出NAFLD细胞模型。脂肪变性的肝细胞中UCP2表达较正常肝细胞增加，且与脂肪变程度呈正相关，与细胞内TG含量呈正相关，与细胞内的ATP含量呈负相关。UCP2的表达在蛋白质和核酸水平具有不一致性。UCP2对脂肪变的肝细胞无明显保护作用，甚至会加重细胞损伤。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文对照索引

声明

第一部分肝细胞非酒精性脂肪变模型的制备及细胞损伤情况的研究

1.1材料

1.1.1实验用肝细胞

1.1.2主要试剂

1.1.3主要仪器

1.1.4主要试剂配制

1.2方法

1.2.1肝细胞培养

1.2.2肝细胞生长曲线的绘制

1.2.3细胞活力的检测和油红O染色

1.2.4细胞内TG、ATP及培养液中ALT、AST检测

1.3结果

1.3.1确定肝细胞对数生长期

1.3.2、台盼蓝染色计数细胞活力

1.3.3、细胞染色结果

1.3.4、生化指标的检测

1.4讨论

第二部分 UCP2在不同程度脂肪变的肝细胞中表达的研究

2.1材料与方法

2.1.1研究对象

2.1.2主要试剂

2.1.3主要试剂的配制

2.1.4主要仪器

2.2 Western-blot检测细胞内UCP2的表达情况

2.2.1细胞培养及肝细胞脂肪变模型的建立

2.2.2总蛋白的提取和定量

2.2.3SDS-PAGE电泳

2.2.4转膜

2.2.5抗体孵育

2.2.6化学发光，显影，定影

2.3 RNA的提取和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)

2.3.1提取总RNA

2.3.2 RNA纯度的测定

2.3.3 RT-PCR

2.4统计学处理

2.5结果

2.5.1 正常肝细胞及脂肪变肝细胞内UCP2蛋白表达情况

2.5.2正常肝细胞及脂肪变肝细胞UCP2mRNA表达情况

2.5.3肝细胞及肝癌细胞内UCP2mRNA表达情况比较

2.5.4肝细胞内ATP、TG含量与UCP2表达情况的相关性分析

2.6讨论

2.6.1 NAFLD模型的建立

2.6.2正常细胞及脂肪变的肝细胞内UCP2表达的意义

2.6.3 UCP2核酸和蛋白水平表达的不一致性

2.6.4不同细胞内UCP2表达的意义

总结

第三部分综述：UCP2与非酒精性脂肪性肝病关系研究进展

引言

3.1 UCP2的作用

3.1.1 UCP2的概述

3.1.2UCP2与脂肪酸的相互作用

3.1.3 UCP2与反应性氧簇的生成

3.1.4UCP2与胰岛素的分泌

3.1.5 UCP2与细胞凋亡

3.2 UCP2与NAFLD的进展

3.2.1 UCP2与脂肪性肝炎

3.2.2 NAFLD时UCP2表达的细胞特异性

3.3结语

主要结论和展望

4.1主要结论

4.2展望

参考文献

致 谢

攻读硕士学位期间发表的文章