一种新CD44变异体在乳腺癌耐药细胞株中表达及其对乳腺癌细胞株生物学行为的影响

摘要

目的：1．构建人CD44基因变异体(CD44variant，CD44v)真核表达载体(pcDNA3.1—CD44v)，并将其稳定转染入人乳腺癌细胞株(MCF-7)中，为深入研究CD44v基因的功能奠定基础。2．将人乳腺癌多药耐药细胞株(MCF-7/Adr)中新发现的CD44v(GeneBankNo．FJ216964)转染入MCF-7细胞株中，观察MMP-2、MMP-9表达水平的变化，分析CD44v与MMP-2、MMP-9表达的关系，研究CD44v对MCF-7细胞株侵袭能力的影响，探讨CD44v调节MMP-2、MMP-9表达的胞内信号转导机制。3．观察转染pcDNA3.1—CD44v前后，MCF-7细胞株增殖方面的差异。 方法：1．采用RT—PCR及流式细胞术，鉴定MCF-7及MCF-7/Adr细胞株中CD44基因及蛋白的表达。2．从MCF-7/Adr细胞中提取总RNA进行RT—PCR，获得全长cDNA模板，使用含有限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅠ酶切位点引物进行PCR反应，从而获得带有酶切位点CD44基因产物，PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，并参照胶回收试剂盒说明书对PCR产物进行回收，纯化。3．将PCR纯化产物连接于pMD19—Tsimplevector上，TA克隆后，提取质粒并测定含量及进行双酶切反应验证，将含阳性质粒转化菌进行DNA测序。4．KpnⅠ和EcoRⅠ分别双酶切真核表达载体pcDNA3.1和CD44TA克隆质粒，T4连接酶定向连接，大肠杆菌扩增，小提质粒后酶切鉴定，阳性质粒进行测序验证。5．脂质体法将pcDNA3.1—CD44v质粒转染到MCF-7细胞中，48小时后RT—PCR和流式细胞术检测转染前后CD44基因、蛋白在MCF-7细胞中的表达变化。6．透明质酸(hyaluronan，HA)处理细胞24小时后，收集各实验组细胞进行RT—PCR检测，检测各组细胞CD44v，MMP-2及MMP-9mRNA表达情况，并收集细胞培养上清，离心后进行明胶酶谱法分析MMP-2、MMP-9蛋白活性，从而了解CD44v对MMP-2、MMP-9表达水平的影响。7．Transwell检测各实验组细胞侵袭力变化情况。8．westernblotting检测erk及磷酸化erk(p—erk)变化，从而探讨CD44v调节MMP-2及MMP-9表达的胞内信号转导机制。9．显微计数法及流式细胞术检测CD44v对MCF-7/CD44v细胞增殖能力的影响。 结果：1．CD44基因在多药耐药MCF-7/Adr细胞中高表达，而在亲代敏感细胞株MCF-7中不表达。2．将该CD44基因克隆入pMD19—T载体中，经TA克隆后进行测序验证，结果显示：该CD44v包含CD44基因1-4号外显子、16-17号外显子、18号外显子1-205位硷基；将该基因序列登录NCBI，基因登录号FJ216964。3．将CD44v成功克隆入pcDNA3.1质粒中，产生重组质粒pcDNA3.1—CD44v，并通过酶切及DNA测序验证。4．转染重组质粒pcDNA3.1—CD44v48小时后，通过RT—PCR方法，在MCF-7中检测到CD44基因mRNA表达明显上调，流式细胞术检测发现CD44蛋白表达水平上调，表达率为(70.0±2.5)％；将上述表达CD44基因及蛋白的瞬时转染MCF-7细胞经G418筛选后获得阳性克隆。5．转染重组质粒载体pcDNA3.1—CD44v并用透明质酸处理作用24小时后，MCF-7细胞株中MMP-2、MMP-9mRNA表达明显上调，相应蛋白活性与mRNA水平呈现一致性改变，细胞侵袭力明显上调(P＜0.05)；透明质酸(HA)→CD44通过ras信号依赖性的方式调节MMP-2、MMP-9表达及转染细胞(MCF-7/CD44v)侵袭力。6．中和性CD44单抗预处理MCF-7/CD44v细胞后，显著阻断了MMP-2，MMP-9分泌及MCF-7/CD44v细胞侵袭力。7．CD44v可以使MCF-7/CD44v细胞增殖能力下降。 结论：1．在MCF-7/Adr中新发现一种CD44v(GeneBankNO．FJ216964)，成功克隆和建立人CD44v真核表达质粒载体(pcDNA3.1—CD44v)，将该质粒载体导入MCF-7细胞后，CD44v表达明显上调，这为进一步研究其功能打下了基础。2．在MCF-7细胞中，CD44v可以通过上调MMP-2、MMP-9表达水平，从而增加肿瘤细胞的侵袭能力。3．透明质酸可能与CD44受体相结合，通过CD44→ras→MAPK信号传导通路调节MMP-2、MMP-9产生，从而增加肿瘤细胞的侵袭能力。4．中和性CD44单抗预处理MCF-7/CD44v细胞后，可以显著阻断MMP-2、MMP-9分泌，降低MCF-7/CD44v细胞侵袭力。5．CD44v过表达可以抑制MCF-7/CD44v细胞增殖能力。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写索引

声明

绪论

1.1肿瘤的播散

1.1.1肿瘤侵袭和转移的基本过程

1.1.2肿瘤侵袭和转移的分子机制

1.2 CD44家族成员

1.2.1 CD44的蛋白结构和功能

1.2.2 CD44分子在人类恶性肿瘤中的表达

1.2.3 CD44与肿瘤转移的关系

1.3 MMPs的家族成员及功能

1.3.1 MMP-2、MMP-9的分子结构

1.3.2 MMP-2、MMP-9的调节

1.3.3MMP-2、MMP-9在乳腺癌组织中表达与预后的关系

1.4课题的着眼点和主要的研究思路

第一部分人CD44基因真核表达载体构建及在乳腺癌细胞株中表达

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2方法

2.2结果

2.2.1 MCF-7细胞及MCF-7/Adr细胞CD44的表达

2.2.2 CD44基因克隆及酶切鉴定

2.2.3真核表达载体pcDNA3.1-CD44v的酶切鉴定

2.2.4转染前后CD44基因和蛋白的表达情况

2.2.5 G418筛选获得稳定表达CD44的MCF-7细胞克隆

2.3讨论

2.4本章小结

第二部分CD44变异体增强MCF-7细胞的侵袭作用

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果

3.2.1 CD44v及MMP-2、MMP-9 mRNA的表达情况

3.2.2明胶酶谱法分析MMP-2、MMP-9的活性

3.2.3 Western blotting检测HA及MAPKs通路抑制剂对erk及p-erk表达的影响

3.2.4明胶酶谱法检测HA及MAPKs通路抑制剂对MMP-2，MMP-9分泌的影响

3.2.5 CD44变异体对MCF-7细胞侵袭能力的影响

3.3讨论

3.4本章小结

第三部分CD44V对人乳腺癌细胞株细胞增殖的影响

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2方法

4.2结果

4.2.1CD44变异体促进MCF-7细胞增殖

4.2.2CD44变异体对细胞周期的影响

4.3讨论

4.4本章小结

5主要结论与展望

5.1主要结论

5.2展望

参考文献

攻读硕士期间发表文章

致谢