TLR4在anti-β2GPI/β2GPI复合物诱导THP-1细胞表达TF中的作用探讨

摘要

目的：Toll样受体(TLRs)不仅是参与天然免疫反应的重要受体，也是连接天然免疫和特异性免疫的桥梁。最新研究提示，TLRs及其信号转导途径可能参与抗磷脂综合征(APS)的病理机制。本论文重点探讨TLR4在抗磷脂抗体/抗原复合物(anti-β2GPI/β2GPI复合物)诱导单核细胞株THP-1细胞表达组织因子(tissue factor，TF)中的作用；以及TLR4的作用是否依赖细胞表面另一分子—膜联蛋白Ⅱ(Annexin A2，ANX2)。
　　 方法：①利用荧光定量PCR(Real-time PCR)检测anti-β2GPI/β2GPI诱导THP-1细胞TF mRNA的表达，采用试剂盒检测细胞TF活性。②利用自制的β2GPI胶联亲和层析柱(β2GPI-Affi-Gel)分析β2GPI与THP-1细胞表面相应受体结合情况。③Real-time PCR及Western蛋白印迹检测anti-β2GPI/β2GPI复合物诱导细胞表达TLR4、MyD88(髓样分化因子88)、MD-2(髓样分化蛋白-2)情况。④观察TLR4途径抑制物—紫杉醇是否干预anti-β2GPI/β2GPI复合物对细胞的作用。⑤利用本课题组已有的ANX2 RNA干扰慢病毒(LV-RNAi-ANX2)感染THP-1细胞，验证内源干扰效率，建立ANX2 RNAi细胞模型。⑥检测anti-β2GPI/β2GPI复合物对慢病毒LV-RNAi-ANX2感染后THP-l细胞的TLR4、MyD88、MD-2以及TF的表达变化。
　　 结果：①Anti-β2GPI/β2GPI复合物(100μg/ml)显著增加THP-1细胞TF mRNA水平及TF活性(与对照比较p＜0.05)。②THP-1细胞表面的TLR4及ANX2能够结合于β2GPI-Affi-Gel柱，从而被洗脱下来。③Anti-β2GPI/β2GPI复合物(100μg/mi)刺激THP-1细胞表达TLR4、MyD88、MD-2明显升高(与对照比较p＜0.05)。④紫杉醇(1μmol/L)能够抑制anti-β2GPI/β2GPI复合物对细胞的刺激效应。⑤慢病毒按最佳MOI值100感染THP-1细胞，病毒感染THP-1细胞后ANX2的mRNA和蛋白水平的表达均被沉默。⑥采用同样的anti-β2GPI/β2GPI复合物刺激ANX2沉默后的THP-1细胞，其TLR4、MyD88、MD-2表达水平明显减弱；且TF的表达也显著降低(与未干扰细胞比较p＜0.05)。
　　 结论：TLR4及相关信号分子在anti-β2GPI/β2GPI复合物诱导THP-1细胞表达TF过程中具有重要作用，并且部分依赖ANX2。紫杉醇可以干预这一过程，为APS血栓形成的预防及治疗提出了新思路。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1 TLRs的发现

1.2 TLRs的结构与分布

1.3 TLRs的配体

1.4 TLRs的激活及信号转导机制

1.4.1 MyD88依赖性信号转导途径

1.4.2 MyD88非依赖性信号转导途径

1.5 TLRs信号转导的负调控机制

1.6 TLR家族成员在抗磷脂综合征病理机制形成中的作用

1.6.1抗磷脂综合征

1.6.2 TLR4与抗磷脂综合征

1.6.3 TLR2、TLR7和TLR8与抗磷脂综合征

1.7 TLRs与其他疾病

1.7.1 TLRs与系统性红斑狼疮

1.7.2 TLRs与艾滋病(AIDS)

1.8结语

第二章研究目的、方法、实验设计方案及意义

2.1研究目的

2.2研究方法

2.3实验设计方案

2.4研究意义

第三章TLR4及相关信号分子MyD88和MD-2在anti-β2GPI/β2GPI复合物诱导THP-1细胞表达TF中的作用

3.1材料

3.1.1主要试剂

3.1.2其它试剂

3.1.3主要溶液

3.1.4主要仪器

3.2方法

3.2.1 单核细胞株THP-1细胞的培养

3.2.2 β2GPI亲和柱的制备

3.2.3 β2GPI与THP-1细胞相应受体结合分析

3.2.4细胞总RNA的提取和逆转录

3.2.5 Real-time PCR分析

3.2.6细胞总蛋白的提取及Western蛋白印迹

3.2.7 TF活性检测

3.2.8统计学分析

3.3结果

3.3.1 Anti-β2GPI/β2GPI诱导THP-1细胞表达TF mRNA及活性

3.3.2 β2GPI与THP-1细胞相应受体结合

3.2.3 Anti-β2GPI/β2GPI作用于THP-1细胞不同时间对TLR4、MyD88、MD-2表达的影响

3.3.4不同刺激物对THP-1细胞TLR4、MyD88及MD-2表达的影响

3.3.5不同浓度紫杉醇对anti-β2GPI/β2GPI诱导TLR4、MyD88及MD-2蛋白表达的影响

3.3.6 1μmol/L紫杉醇对不同刺激物刺激THP-1细胞TLR4、MyD88、MD-2的表达的影响

3.3.7 1μmol/L紫杉醇对不同刺激物刺激THP-1细胞TF表达的影响

3.4讨论

第四章TLR4是否依赖ANX2在anti-β2GPI/β2GPI复合物诱导THP-1细胞表达TF中起作用?

4.1材料

4.1.1 主要试剂和仪器

4.2方法

4.2.1 单核细胞株THP-1细胞的培养

4.2.2 病毒感染

4.2.3干扰效率内源验证

4.2.4 TLR4、MyD88、MD-2基因和蛋白水平达及TF活性的检测

4.2.5统计学分析

4.3结果

4.3.1 细胞感染病毒后荧光的观察

4.3.2 ANX2干扰效率验证

4.3.3 ANX2 RNAi对anti-β2GPI/β2GPI复合物诱导THP-1细胞表达TLR4、MyD88及MD-2 mRNA水平的影响

4.3.4 ANX2 RNAi对anti-β2GPI/β2GPI复合物诱导THP-1细胞表达TLR4、MyD88及MD-2蛋白水平的影响

4.3.5 Anti-β2GPI/β2GPI复合物诱导ANX2 RNAi的THP-1细胞TF mRNA表达及TF活性

4.4讨论

第五章主要结论及展望

5.1主要结论

5.2展望

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的文章及参加学术会议