骨形态发生蛋白-2/注射式硫酸钙缓释载体与大鼠骨髓间充质干细胞的体外生物相容性研究

摘要

骨组织工程在解决临床骨缺损这一棘手问题上具有许多优势,是近年来研究的热点。良好的支架材料和生长因子对细胞的粘附,增殖、分化具有决定性作用。然而生长因子存在稳定性差、半衰期短等不足,限制了其临床应用,利用载体或缓释系统负载生长因子,既能保护生长因子的生物活性,又可以使生长因子缓慢释放,从而持续促进细胞生长及组织修复再生,因而控释载体材料的应用是目前组织工程研究的热点。骨形态发生蛋白-2(Bonemorphogeneticprotein-2,BMP-2)能诱导和加速MSCs向成骨样细胞分化。注射式硫酸钙(InjectableCalciumSulfateCement,ICSC)是医用半水硫酸钙的衍生产品之一,可以作为支架材料搭载糖蛋白,氨基苷类抗生素。因此本实验应用骨组织工程学方法,将BMP-2负载于ICSC上,制备BMP-2缓释载体,探讨其缓释性能以及对大鼠骨髓间充质干细胞增殖,分化的影响。旨在通过体外实验为BMP-2寻找较理想的缓释载体,为临床修复骨缺损提供一种微创治疗方式。
　　 第一部分骨形态发生蛋白-2/注射式硫酸钙缓释载体对大鼠骨髓间充质干细胞体外成骨诱导的影响
　　 目的:研究骨形态发生蛋白-2(BoneMorphogeneticProtein-2,BMP-2)/注射式硫酸钙(InjectableCalciumSulfateCement,ICSC)复合载体对大鼠骨髓间充质干细胞(MarrowMesenchymalStemCells,MSCs)的体外诱导成骨的影响。
　　 材料和方法:颈椎脱臼处死SD大鼠,无菌条件下取其股骨、胫骨,用含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM培养液冲洗骨髓腔,冲出骨髓,淋巴细胞分离液分离后,常规传代培养。取第三代生长状态良好的细胞,应用免疫细胞化学法测定骨髓间充质干细胞表型。种植于两种载体体外复合培养。实验分三组:实验组A:单纯BMP-2;实验组B:BMP-2/ICSC;C组:空白对照组。通过检测缓释载体上种植细胞后不同时间点(3,7,10,14d)载体上细胞数,碱性磷酸酶活性,同时应用碱性磷酸酶,茜素红及冯库萨染色对复合培养的细胞进行成骨细胞表型鉴定。
　　 结果:第三代MSCs经复合培养7d后,实验组A,B两组碱性磷酸酶染色为阳性,对照组阴性;三组载体中细胞数量均随培养时间延长而增长,实验组B的细胞数增加最快,与相同时间点其他各组材料中细胞数差异有显著性(P＜0.05);各时间点细胞碱性磷酸酶活性表达实验组B最高,对照组最低,差异亦有显著性(P＜0.05);实验A,B冯库萨,茜素红染色均为阳性,C组阴性。
　　 结论:MSCs在BMP-2/ICSC载体上培养后可具有成骨细胞特性。该载体能诱导MSCs向成骨细胞分化,能够保留BMP-2的生物活性,可以作为较理想的生长因子载体应用于骨组织工程。
　　 第二部分骨形态发生蛋白-2/注射式硫酸钙缓释载体与大鼠骨髓间充质干细胞的体外生物相容性
　　 目的:观察骨形态发生蛋白-2/注射式硫酸钙缓释系统的体外缓释效果及与种子细胞的生物相容性。
　　 材料和方法:大鼠骨髓间充质干细胞经体外诱导培养、扩增后种植于骨形态发生蛋白-2/注射式硫酸钙缓释载体和单纯的注射式硫酸钙行体外培养。测定缓释支架材料上骨形态发生蛋白-2的释放量和持续时间;种植细胞后细胞的黏附率;培养3,7,10,14d时支架材料中细胞数、碱性磷酸酶活性,7d行碱性磷酸酶染色,14d行茜素红染色和冯库萨染色,并在扫描电镜下观察载体上细胞生长情况。实验分两组:实验组:BMP-2/ICSC;对照组:ICSC。体外用磷酸盐缓冲溶液(PhosphateBufferedSolution,PBS)浸泡支架,应用酶联免疫吸附试剂测定方法(EnzymeLinkedImmuno-SorbentAssay,ELISA)检测实验组不同时间点缓释液内的BMP-2含量,绘制释放曲线,确定释放时间,评价载体缓释性能。
　　 结果:该缓释支架具有一定的骨形态发生蛋白-2缓释效果,持续时间可达31d。第3代大鼠骨髓间充质干细胞经成骨诱导培养,可表达成骨细胞表型,实验组碱性磷酸酶细胞化学染色、茜素红染色和冯库萨均为阳性,对照组阴性。体外实验显示该缓释支架与大鼠骨髓间充质干细胞具有优良的生物相容性,相同时间点实验组的细胞黏附率、支架上细胞数量及细胞碱性磷酸酶活性均明显高于对照组(P＜0.05);扫描电镜发现两组材料上均有细胞生长,但实验组的细胞生长状况明显好于对照组。
　　 结论:该载体能够缓慢持续地释放BMP-2,有平台期,具备稳定的缓释性能。该载体与大鼠骨髓间充质干细胞有良好的生物相容性。