RpoE在伤寒沙门菌克服环境高渗应激中的基因表达调节机制研究

摘要

伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi，S.Typhi)是一种重要的人类肠道致病菌，是目前研究最为广泛和深入的原核生物之一。伤寒沙门菌常通过污染食物经消化道入体内，在空肠远端入侵肠上皮细胞，并进一步在局部肠系膜淋巴组织中存活和增殖，再经淋巴液和血液进入肝、脾等全身组织，造成全身性感染并能引发肠穿孔等严重的并发症从而危及患者生命。
　　 作为人类食源性致病菌，伤寒沙门菌在从环境到使宿主致病的过程中，需要遇到一系列剧烈的环境应激，包括人的肠道高渗应激环境。在高渗应激条件下，细菌需要及时有效地调节某些基因的表达和蛋白的活性来适应环境。原核生物基因表达均是由sigma因子介导转录起始，且多数呈操纵子模式，并受各种调节因子的影响。不同的sigma因子(σ因子)特异性识别并引导RNA聚合酶结合到目的基因启动子区域，启动相应基因表达，无疑是原核生物对其生命活动进行调控的最基本的方式。已知不同的sigma因子的作用不同，不同的sigma因子对某些基因或有共调节作用，但缺乏直接的研究证据。RpoE是响应环境应激的sigma因子。已有研究发现RpoE是肠杆菌科细菌中一个重要的sigma因子，在响应多种环境应激时发挥着重要作用，对细菌生存和致病性至关重要，但其在伤寒沙门菌中作用的研究报道尚少。
　　 目的：本研究旨在了解与RpoE相关的参与伤寒沙门菌克服高渗应激的效应蛋白基因，深入分析RpoE对重要致病因子表达调控的机制，研究RpoE在伤寒沙门菌克服高渗应激过程中与另一sigma因子RpoS对基因表达的共调节作用，以加深对伤寒沙门菌基因表达调控网络和致病分子机制的认识。
　　 方法：
　　 (1)基因缺陷变异株的制备采用自杀质粒pGMB151介导的同源重组方法，制备伤寒沙门菌rpoS缺陷变异株及rpoE/rpoS双缺陷变异株。
　　 (2)rpoE基因缺陷回补株的构建PCR扩增rpoE基因，酶切后与表达载体pBAD/gⅢ定向连接，热击法转入大肠杆菌DH5α中筛选阳性质粒，经序列分析鉴定后，电击法转入rpoE基因缺陷变异株。
　　 (3)高渗应激下生长情况分析以生长时间为横坐标，细菌OD600值为纵坐标绘制生长曲线，对比缺陷变异株、野生株及基因缺陷回补株在高渗应激条件下的生长情况。
　　 (4)动力试验分析缺陷变异株和野生株37℃培养过夜，分别取4μl菌液接种于0.3％高渗半固体LB培养基，37℃培养8小时后测量动力圈直径，观察缺陷株及野生株的动力。
　　 (5)伤寒沙门菌基因表达谱分析伤寒沙门菌全基因组芯片分析目的基因在转录水平上对其他基因的表达调控。体外模拟高渗环境应激后分别提取伤寒沙门菌野生株和基因缺陷变异株的总RNA，反转录成cDNA并标记荧光(cy3或cy5)，与基因组芯片杂交，扫描后根据荧光信号分析各基因转录表达水平，比较伤寒沙门菌野生株和基因缺陷变异株在高渗应激早期的基因表达谱差异。
　　 (6)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析选择基因芯片结果中部分差异表达基因，设计特异性引物，进行反转录和实时定量PCR，以验证DNA芯片分析结果。
　　 (7)蛋白质二维电泳和质谱分析高渗应激后分别提取rpoE缺陷变异株和野生株的菌体蛋白和分泌蛋白。取适量蛋白进行等点聚焦和SDS-PAGE电泳分离后，以考马斯亮蓝G-250染色后扫描成像，分析蛋白表达差异，选取明显表达差异蛋白进行质谱分析；质谱分析的肽指纹图在www.mascot进行比对。
　　 (8)Western免疫印迹分析分泌蛋白高渗应激条件培养rpoE缺陷株、野生株，利用三氯醋酸-丙酮法提取培养上清中的分泌蛋白，以抗H：z66多克隆抗体进行Western免疫印迹分析rpoE缺陷株、野生株分泌Z66蛋白的差异。
　　 (9)凝胶阻滞试验根据伤寒沙门菌rpoE基因序列设计引物，扩增rpoE基因片段，与表达载体pET-28a连接经热击法转化入大肠杆菌JM109，用IPTG诱导表达RpoE蛋白，用镍柱纯化RpoE蛋白。根据伤寒沙门菌fliA基因序列设计特异性引物，扩增fliA基因启动子区域，取2μg PCR产物与不同浓度的RpoE蛋白混合，加入相应体积的GSM缓冲液，反应总体积为20μl，30℃孵育15 min。选取真核生物DNA片段作为阴性对照，8％的丙烯酰胺胶电泳分离条带，溴化乙锭染色。
　　 (10)HeLa细胞侵袭试验细菌培养至OD600为1.0，加入培养有HeLa细胞的24孔板中(MOI=20)，90 min后收集一部分细胞，加入裂解液，涂LB平板过夜培养，计细菌克隆数，代表细菌粘附细胞水平T0；另一部分加入庆大霉素杀死胞外细菌，继续培养90 min，裂解细胞后涂板过夜培养，计克隆数代表细菌的侵袭水平T90，用T90/T0的值代表细菌的侵袭力。
　　 结果：
　　 (1)研究用菌株制备经PCR及序列分析证实成功构建伤寒沙门菌rpoS基因缺陷变异株、rpoE/rpoS双缺陷变异株；成功构建pBAD-rpoE阳性重组载体，并成功将重组载体导入相应的缺陷株中，制备成rpoE基因缺陷回补株。
　　 (2)生长曲线分析结果显示rpoE基因缺陷变异株在高渗应激条件下生长能力明显弱于野生株，在回补rpoE基因后得到明显恢复；rpoS基因缺陷株在高渗应激条件下生长能力亦明显弱于野生株，rpoE/rpoS双缺陷变异株在高渗应激条件下生长能力均明显弱于野生株和rpoE、rpoS单基因缺陷株。
　　 (3)高渗应激下RpoE影响基因表达分析基因组芯片分析显示，高渗应激30分钟后，rpoE基因缺陷株相比野生株有74个基因表达下调，56个基因表达上调，选取其中部份差异表达基因利用RT-PCR进行验证，结果显示所选基因表达变化与基因芯片分析结果基本一致，且在回补rpoE基因后表达得到明显恢复。
　　 (4)高渗应激下RpoE对蛋白表达影响的分析二维电泳、质谱分析显示，rpoE缺陷株与野生株相比18个菌体蛋白明显有差异，质谱分析鉴定包括有氨酰组氨酸二肽酶PepD、氨酰组氨酸二肽酶AspA等；分泌蛋白二维电泳后发现rpoE缺陷株与野生株相比有16个明显差异点，质谱分析鉴定包括NAD合成酶NadE，外膜蛋白OmpC等。
　　 (5)RpoE对鞭毛及动力影响机制研究动力试验结果显示，在高渗半固体LB培养平板上，rpoE基因缺陷变异株动力比野生株明显下降，回补rpoE基因后动力明显恢复，提示RpoE在高渗条件下参与调控鞭毛动力；结合高渗应激早期基因芯片发现rpoE缺陷变异株中二级鞭毛基因fliA和三级鞭毛基因表达明显下调，利用qRT-PCR分析一级鞭毛基因flhD、二级鞭毛基因fliA和三级鞭毛基因fljB：z66的表达情况发现，rpoE缺陷变异株中flhD相比野生株没有明显差异，而fliA与fljB：z66的表达在rpoE缺陷变异株中明显下调；Western-bolt发现鞭毛蛋白FljB：z66在rpoE缺陷变异株的表达明显低于野生株；凝胶阻滞试验证实RpoE蛋白可以直接结合fliA基因启动子。
　　 (6)RpoE对伤寒沙门菌侵袭力影响分析 rpoE基因缺陷变异株的侵袭力比野生株明显下降，而rpoE回补株侵袭能力明显恢复；结合基因芯片结果，挑选部分侵袭毒力相关基因进行qRT-PCR，发现这些基因在rpoE缺陷株中表达相对野生株明显下调，在回补rpoE基因后表达明显恢复。
　　 (7)高渗应激下RpoE和RpoS对基因表达的共调节分析利用基因组芯片，进一步分析rpoE基因缺陷株表达谱、rpoS基因缺陷株表达谱和rpoE/rpoS双缺陷株表达谱，发现有38个基因，包括osmC、osmY、otsBA、narUZY、dpS等，在rpoE、rpoS缺陷株中相比野生株表达变化不明显，但在rpoE/rpoS双缺陷株表达明显下调，提示这些基因受RpoE与RpoS的双重调控；选取不同操纵子的6个基因(osmC，osmY，otsB，narU，ugpB和dps)进行qRT-PCR进行验证，结果显示，所选基因表达与基因芯片分析结果一致。
　　 结论：
　　 (1)RpoE在伤寒沙门菌高渗应激时参与fliA、flgK、cheW、glpX、ompC、phoP等致病因子基因的表达调控。
　　 (2)高渗应激下伤寒沙门菌RpoE能直接启动FliA表达，进而调控鞭毛基因表达和影响细菌动力。
　　 (3)RpoE能促进orgA、prgK、sipA、invF、sopE、spaS等侵袭毒力基因表达，进而帮助伤寒沙门菌侵袭上皮细胞。
　　 (4)高渗应激早期，RpoE因子与RpoS因子对osmC、osmY、otsBA、narUZY、dpS等38个基因存在共调控作用。