基于斑马鱼模型的中药壮骨效应评价新方法的建立及应用

摘要

骨质疏松症是一种以骨量减少、骨组织显微结构异常和骨折危险性增加为特征的一类疾病，由于西药长期应用副作用大等缺陷，中药治疗骨质疏松的功效正日益受到重视。但中药治疗骨质疏松的物质基础研究却不能高效进行，主要存在2个瓶颈问题:一是评价模型问题:现有动物骨质疏松模型耗时长，用样量大，劳动强度大，使得活性筛选效率低;现有细胞模型成本高，原代培养难度增加，一般的实验室不能进行;二是化合物的数量问题:由于中药成分复杂，很难分离到能满足体内研究的足量化合物，大量的微量成分只能通过细胞模型进行筛选。在体模型无法实现量微成分的高效抗骨质疏松活性评价，体外细胞模型难以体现中药整体观，已成为壮骨中药及其成分活性筛选的技术瓶颈，因此建立新的壮骨评价方法，使该方法既能体现在体评价的综合效应，又能实现条件简单，高效率，低成本，高灵敏特别是能有效用于微量样品的评价研究，丰富中药壮骨效应评价思路与方法，具有重要意义。
　　 模式生物斑马鱼是近年来被广泛用于高通量药效筛选的重要工具。用糖皮质激素诱导斑马鱼幼鱼骨矿化量减少的斑马鱼骨质疏松模型，可在微孔板中进行药物的在体活性评价，具化合物用量少(μg～mg)，简单、高效、高灵敏及低成本的优势，可有效用于中药成分特别是量微成分及其复杂体系的抗骨质疏松活性评价。该模型最大限度地保留了在体动物的完整性，克服哺乳动物实验强度大，耗时长、低灵敏，用样量大，量微成分难以评价;克服细胞模型条件要求苛刻，作用环节单一等缺陷。本研究拟建立斑马鱼骨质疏松模型，并应用此模型来评价筛选中药抗骨质疏松活性成分。主要内容如下:
　　 1.建立斑马鱼骨质疏松模型
　　 借鉴国外已有斑马鱼骨质疏松模型及药物筛选的研究基础，从以下几方面着手该模型的方法学研究:①斑马鱼鱼龄的选择:选择受精后3天的幼鱼，培养至受精后9天或者10天，以此为实验周期，此时的斑马鱼幼鱼头部发育模式与哺乳动物类似，且幼鱼体积小，给药量少，适合高通量筛选;②给药方式方法:通过将药物溶解在斑马鱼生活的水环境中，给药方便;③造模药物的选择:选择地塞米松、泼尼松龙和维甲酸为模型药，结果显示地塞米松和泼尼松龙可成功诱导斑马鱼骨质疏松;④药物剂量选择;⑤暴露时间:将斑马鱼幼鱼从受精后4天或者5天开始暴露于模型药中，培养至受精后9天或者10天，给药组可在幼鱼暴露于模型药48小时后开始加入共同培养，也可与模型药在幼鱼受精后4天或者5天时一同加入培养;⑥骨骼染色:选择经典的茜素红染色矿化的斑马鱼头部骨骼，方法可靠，易于观察;⑦骨矿化定量分析:将茜素红染色的幼鱼在倒置显微镜下拍照，使用专业的图像处理软件得到斑马鱼幼鱼染色的骨骼矿化面积和累积光密度，将可视的图片转化为可读性的数据，来定量分析斑马鱼骨量;⑧数据处理:使用excel处理数据并分析;⑨斑马鱼模型与现有模型比对分析。
　　 2.应用斑马鱼骨质疏松模型评价续断成分的抗骨质疏松活性
　　 应用斑马鱼骨质疏松模型评价续断总提物，部位及单体成分（续断皂苷Ⅵ、3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖-常春藤皂苷元和川续断皂苷Ⅴ）的抗骨质疏松活性，以考查斑马鱼模型评价中药成分特别是量微成分及其复杂体系活性的适用性。结果续断总提物和续断单体（续断皂苷Ⅵ、3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖-常春藤皂苷元和川续断皂苷Ⅴ）在一定浓度范围内可阻止斑马鱼幼鱼的骨量丢失，在此研究基础上，采用溶剂萃取、D101树脂和高效液相色谱法分离续断不同部位，根据现代色谱高效分离和鉴定技术的优点，进一步提出斑马鱼骨质疏松模型联合现代色谱高效筛选中药续断抗骨质疏松活性成分的新方法，将高效液相色谱分离的续断不同时间段流出物收集，定向分离所需续断化合物的化学成分，将续断80min内的液相流出物分为5个时间段0-24min、24-35min、35-46min、46-60min和60-80min，并分别使用斑马鱼骨质疏松模型评价其活性，结果显示24min-80min内的续断成分有抗斑马鱼骨质疏松的作用，并将27-46min进一步使用HPLC分离进一步确定活性成分。