甘草皂苷与枘酮组分对Caco-2细胞P-gp功能与表达的影响

摘要

中药甘草(Radix Glycyrrhiza)为豆科植物的根及根茎。具有益气复脉、缓急止痛、润肺止咳、泻火解毒及调和诸药五大药理功效。配伍应用广泛，有“十方九草”之说，解毒是其重要的作用之一。甘草水提取液可通过活化孕烷X受体(PXR)诱导肝脏代谢酶CYP3A酶系的表达，促进体内毒物的代谢与排泄，从而起到解毒的效果。而PXR也是P-gp的调控因子之一，但甘草对P-gp的研究鲜有报道，甘草化学成分复杂，而不同化学成分对药物转运蛋白P-gp的影响可能相同也可能相反，但总的影响可能是这些活性成分综合作用的结果。阐明甘草主要活性组分及其成分对P-gp的影响，才能更好的阐释甘草解毒作用机制。
　　 本课题以药物转运蛋白P-gp为靶点研究甘草解毒作用机制，为甘草复方配伍解毒机理的研究提供新的思路和方法;主要内容:
　　 1.甘草总皂苷和总黄酮的制备、检测。
　　 通过30％乙醇回流提取甘草，提取液经AB-8大孔树脂柱和聚酰胺柱得甘草总皂苷。采用AlltimaC18色谱柱(4.6mm×150mm，Sμm)，流动相:乙腈(A)-0.05％磷酸水溶液(B)，流速1.0ml/min，检测波长254nm，柱温25℃检测得到的甘草总皂苷。结果表明甘草酸在甘草总皂苷中含量最高，约占35％。
　　 通过90％乙醇回流提取甘草，提取液经聚酰胺柱得到甘草总黄酮。采用AlltimaC18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)，流动相:乙腈(A)-0.05％磷酸水溶液(B)，流速1.0ml/min，检测波长276nm，柱温25℃检测得到的甘草总黄酮。结果表明甘草总黄酮所含主要成分分别为甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、芹糖基甘草苷、芹糖基异甘草苷，含量分别为22.05％、8.53％、11.05％、0.48％、5.24％、8.98％。
　　 2.甘草不同组分/成分及P-gp底物马钱子碱对Caco-2细胞存活率的影响
　　 采用MTT法判断各试验药物对Caco-2细胞的毒性，保证试验过程中细胞的活性。选择细胞存活率大于90％的药物浓度作为无毒浓度进行各试验药物对P-gp功能和表达以及P-gp底物马钱子碱跨膜转运影响的研究。MTT实验结果显示，5、10、50、100、200、400μg/mL的Gly、LF和5、10、50、100、200、400μmol/L的GA、Liq、Iliq.Liqu、Iliqu、Liqa、Iliqa以及5、10、50、100、200μmol/L的Bru与细胞培养72h后细胞存活率均＞90％。。故选取5-400μg/mL的Gly、LF和5-400μmol/L的GA、Liq、Iliq、Liqu、Iliqu、Liqa、Iliqa以及5-200μmol/L的Bru进行下一步研究。
　　 3.甘草总皂苷及其主要成分对Caco-2细胞P-gp功能和表达的影响
　　 使用流式细胞仪测定罗丹明123荧光强度，分析甘草总皂苷及其主要成分甘草酸对P-gp介导的Rho-123外排作用的影响，以此反映P-gp功能的变化。结果表明甘草总皂苷和甘草酸作用Caco-2细胞1h后，5、10、50μg/mL的甘草总皂苷和5、10、50μmol/L甘草酸使细胞内罗丹明123的荧光强度较阴性对照组分别减少了41.4％、37.4％、34.8％;33.3％、29.9％、27.5％，对P-gp功能表现出诱导作用(P＜0.01)，呈现浓度依赖性。
　　 将甘草总皂苷及其主要成分甘草酸与Caco-2细胞作用72h，以环抱素A作为诱导P-gp蛋白表达的阳性对照，不加药处理的Caco-2细胞作为阴性对照，采用Westenblot分别研究各试验药物对P-gp蛋白表达的影响。结果表明甘草总皂苷、甘草酸作用Caco-2细胞72h后，阳性对照组细胞P-gp的蛋白表达显著高于阴性对照组(P＜0.01)，能上调P-gp蛋白表达。不同剂量的甘草总皂苷、甘草酸对Caco-2细胞P-gp的蛋白表达较阴性组相比分别显著增加(P＜0.01)，对P-gp蛋白表达表现出诱导作用，呈现浓度依赖性。
　　 4.甘草黄酮类成分对Caco-2细胞P-gp功能和表达的影响
　　 使用流式细胞仪测定罗丹明123荧光强度，分析甘草总黄酮及其主要成分甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、芹糖基甘草苷、芹糖基异甘草苷对P-gp介导的Rho-123外排作用的影响，以此反映P-gp功能的变化。结果表明甘草总黄酮作用Caco-2细胞1h后，5、10、50、100μg/ml的甘草总黄酮使细胞内罗丹明123的荧光强度较阴性对照组分别减少了61.1％、56.3％、49.2％、45.4％，对P-gp功能表现出诱导作用(p＜0.01），呈现浓度依赖性。5、10、50、100μmol/L的甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、芹糖基甘草苷、芹糖基异甘草苷使细胞内罗丹明123的荧光强度较阴性对照组分别减少了35.4％、31.2％、28.4％、22.9％,33.4％、29.2％、27.4％、25.1％,37.9％、34.2％、29.9％、28.2％,33.3％、27.8％、24.3％、20.4％,34.6％、31.6％、22.9％、19.3％,32.7％、31.1％、25.1％、21.1％，对P-gp功能表现出诱导作用(p＜0.01），呈现浓度依赖性。
　　 将甘草总黄酮及其主要成分甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、芹糖基甘草苷、芹糖基异甘草苷与Caco-2细胞作用72h，采用Westenblot分别研究各试验药物对P-gp蛋白表达的影响。结果表明10-400μg/mL的甘草总黄酮对Caco-2细胞P-gp的蛋白表达较阴性组相比分别显著增加(P＜0.01)，对P-gp蛋白表达表现出诱导作用，呈现浓度依赖性。5-400μmol/L的甘草苷、异甘草苷、甘草素、芹糖基甘草苷对Caco-2细胞膜上P-gp的蛋白表达较阴性组相比分别显著增加(P＜0.01)，对P-gp蛋白表达表现出诱导作用，呈现浓度依赖性。10-400μmol/L的异甘草素、芹糖基异甘草苷对Caco-2细胞膜上P-gp的蛋白表达较阴性组相比分别显著增加(P＜0.01)，对P-gp蛋白表达表现出诱导作用，呈现浓度依赖性。
　　 5.甘草总皂苷、甘草总黄酮及其主要成分甘草酸、甘草苷以及配伍对P-gp底物马钱子碱双向跨膜转运的影响
　　 在TranswellnTM12孔板上建立Caco-2细胞单层模型，分别考察甘草总皂苷及其主要成分甘草酸，甘草总黄酮及其主要成分甘草苷，甘草总皂苷、甘草总黄酮配伍，甘草酸、甘草苷配伍对P-gp底物马钱子碱双向转运的影响，HPLC测定转运液中马钱子碱的浓度。结果表明阳性对照50μmol/LVer使BruTransportB-A减少，外排率(ER)减小，抑制了Bru的外向转运(p＜0.01)。50μg/mlGly，50μmol/LGA，100μg/mlLF，100μmol/LLiq，50μg/mlGly、100μg/mlLF配伍以及50μmol/LGA、100μmol/LLiq配伍使BruTransportB-A增加，外排比率分别从2.1601上升到到3.9346、3.8828、4.0779、3.9205、5.111、4.8794，对Bru外向转运表现出诱导作用(p＜0.01)。Gly+Ver、GA+Ver、LF+Ver、Liq+Ver、Gly+LF+Ver、GA+Liq+Ver组使BruTransportB-A减少，外排率(ER)减小，对Bru外向转运表现出抑制作用(p＜0.01)，且与Ver阳性对照组差异无统计学意义(p＞0.05)。
　　 结论:本实验提示，甘草主要药效组分甘草总皂苷、甘草总黄酮及其主要成分在一定浓度范围内能诱导P-gp的功能和上调P-gp的表达且能促进细胞内毒物的外排，减少有毒物质在肠道内的吸收，保护机体免受毒害，这可能是甘草配伍一种新的解毒机制。