低聚壳聚糖衍生物的制备及其修饰的磁共振成像造影剂体内外弛豫性能研究

摘要

壳聚糖是自然界中第二大类丰产资源甲壳素脱乙酰化的产物，也是食品工业中的重要原料之一。壳聚糖后加工产品的进一步开发与应用是避免自然资源浪费、扩大壳聚糖应用范围的途径之一，尤其是在具有高附加值的生物医药领域的拓展应用。临床常用的造影剂Gd-DTPA(马根维显，Magnevist(R))在生物体内的对比时间短、弛豫率低、无靶向性，具有一定的毒性，甚至会引起生物体肾细胞的纤维化。利用天然零毒性、可生物降解、具有良好生物相容性的低聚壳聚糖对商用造影剂进行修饰改性，以提高造影剂的弛豫率和体内安全性。本论文的研究内容主要分为以下3个部分:
　　 1.通过微波辅助双氧水降解法制备不同聚合度的水溶性低聚壳聚糖并合成了3种低聚壳聚糖衍生物。研究了低聚壳聚糖及其衍生物作为亲水药物载体模型的潜能。
　　 1.1、通过核磁氢谱(1HNMR)、凝胶过滤色谱(GFC)、红外光谱(IR)等表征了低聚壳聚糖及其衍生物的结构。结果表明壳聚糖在降解过程中只是发生了β-1，4糖苷键的断裂，不存在开环等副反应。当降解得到的低聚壳聚糖的聚合度在20以下时，其分子量分布指数(PDI)大大降低。
　　 1.2、研究了牛血清白蛋白(BSA)在低聚壳聚糖及其衍生物溶液中的紫外(UV)和荧光光谱。结果表明低聚壳聚糖及其衍生物与BSA结合的主要作用力是疏水和氢键作用。BSA的构象在低聚壳聚糖及其衍生物溶液的微环境中没有大的改变，天然活性没有受到影响，说明低聚壳聚糖及其衍生物具有成为良好的水溶性药物载体的潜力。
　　 1.3、通过等温滴定微量热仪(ITC)研究了低聚壳聚糖及其衍生物与活性医药蛋白BSA之间的热力学作用。结果表明，低聚壳聚糖及其衍生物与BSA的作用过程均是放热的，且是自发进行的。低聚壳聚糖与BSA作用的主要驱动力是氢键。低聚壳聚糖衍生物与BSA作用的主要驱动力是氢键和疏水作用。这一结论与紫外和荧光光谱的结果一致。
　　 2.将不同聚合度的低聚壳聚糖对DTPA进行修饰得到新的配体(DTPA(低聚壳聚糖))，再分别与顺磁性Mn(Ⅱ)、Gd(Ⅲ)络合得到新型的功能配合物作为潜在的MRI造影剂，并研究了锰基和钆基配合物的体外弛豫性能。
　　 2.1、通过反转恢复序列研究了DTPA(低聚壳聚糖)锰基和钆基配合物的纵向弛豫率。结果发现钆基配合物的弛豫率不仅高于商业化的造影剂Gd-DTPA，同时也高于锰基配合物。一定条件下配合物的纵向弛豫率均随着修饰的低聚壳聚糖聚合度的增加而增加。DTPA(低聚壳聚糖)锰基和钆基配合物在BSA溶液中的纵向弛豫率均略高于在水溶液中的弛豫率，说明配合物与BSA之间存在相互作用，除了自由态的配合物之外，还形成了配合物-BSA的复合模式。
　　 2.2、通过多层自旋回波序列研究了DTPA(低聚壳聚糖)锰基和钆基配合物的体外T1加权成像。结果表明锰基和钆基配合物的体外T1加权成像所得到的FLASH图像的亮度和对比度与配合物的浓度有一定的线性相关性，同等浓度下DTPA(低聚壳聚糖)钆基配合物的体外成像效果最优。另外研究发现体外T1加权成像的效果与修饰的低聚壳聚糖的聚合度也有一定的关系。
　　 2.3、通过ITC研究了DTPA(低聚壳聚糖)锰基和钆基配合物与BSA之间的热力学作用。结果表明这两类配合物与BSA之间的作用均是自发进行的，熵驱动的，且作用力以疏水作用为主。
　　 3.以DTPA(低聚壳聚糖)钆基配合物为主要研究对象，研究了其在小鼠体内的安全性和大鼠体内核磁成像情况。
　　 3.1、小鼠急性毒性实验结果表明，DTPA(低聚壳聚糖)钆基配合物在注射入小鼠体内一星期后，小鼠仍健康存活，体重正常增加，未见明显的毒性反应。
　　 3.2、小鼠骨髓中嗜多染红细胞(PCE)微核实验结果呈阴性，表明DTPA(低聚壳聚糖)钆基配合物对小鼠的染色体没有危害，没有致突变副作用。
　　 3.3、金属Gd(Ⅲ)在小鼠体内的残留量分析结果表明，Gd(Ⅲ)在小鼠的肝脏和肾脏内的残留量是先增后减的趋势，一天后残留量逐渐减少。Gd(Ⅲ)在小鼠其它脏器内的残留量呈现逐渐降低的趋势，且残留量不大于Gd-DTPA。
　　 3.4、大鼠体内核磁成像研究结果表明，DTPA(低聚壳聚糖)钆基配合物在大鼠体内的保留时间及靶向部位与修饰的低聚壳聚糖的聚合度有关。聚合度为11的低聚壳聚糖修饰的钆基配合物在大鼠肝脏部位的保留时间最长，并且在一定时间内信号强度不降低，有利于肝靶向成像。但是6聚合度的低聚壳聚糖修饰的钆基配合物在肝脏部位没有此效果，其会很快进入肾脏并代谢出体外。