TLR4促进ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化

摘要

目的:观察Toll样受体4(TLR4)是否参与氧化性低密度脂蛋白/β2糖蛋白I/抗β2糖蛋白I（ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI）抗体复合物诱导小鼠腹腔巨噬细胞向泡沫细胞转化，并进一步分析下游信号分子细胞核因子-κB(NF-κB)是否参与这一过程，以探讨TLR4/NF-κB轴在促进ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI诱导泡沫细胞形成及相关活性分子的表达中的作用。
　　方法:(1)分离C3H/HeN（TLR4正常）和C3H/HeJ（TLR4缺陷）小鼠腹腔巨噬细胞后，根据实验要求加入ox-LDL、ox-LDL/β2GPI、β2GPI/抗β2GPI、ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI、脂多糖(LPS)处理48 h，油红O染色观察两组细胞泡沫化情况;细胞内着色脂滴染料光密度(OD)定量分析泡沫细胞生成率。(2)采用Western blotting和实时荧光定量PCR检测ox-LDL、ox-LDL/β2GPI、ox-LDL/抗β2GPI、β2GPI/抗β2GPI、ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI、脂多糖(LPS)不同组合刺激C3H/HeN小鼠腹腔巨噬细胞后TLR4的表达，从而分析ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI对小鼠腹腔巨噬细胞的作用是否促进TLR4的表达。(3)Western blotting检测不同组合刺激两组小鼠腹腔巨噬细胞后，NF-κB p65总蛋白和磷酸化水平变化，从而分析ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI对小鼠腹腔巨噬细胞TLR4/NF-κB通路的影响。(4)小鼠腹腔巨噬细胞经ox-LDL、β2GPI/抗β2GPI、ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI等不同组合处理后，以实时荧光定量PCR检测细胞组织因子(TF) mRNA表达，Xa生成法检测TF活性，进而分析TLR4缺陷对TF表达的影响。(5) ox-LDL、β2GPI/抗β2GPI、ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI等不同组合处理小鼠腹腔巨噬细胞后，酶联免疫吸附法(ELISA)检测刺激后巨噬细胞上清中单核细胞趋化因子-1（MCP-1）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α)的表达变化，从而分析TLR4在细胞泡沫化过程中对活性分子表达的影响。
　　结果:(1) C3H/HeN小鼠组腹腔巨噬细胞经ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物刺激后泡沫细胞生成率增高，与C3H/HeJ小鼠组相比差异明显。(2) ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导C3H/HeN小鼠组腹腔巨噬细胞泡沫化过程中，TLR4表达增加，与空白对照相比差异明显(p＜0.01)。(3) ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导C3H/HeN小鼠组腹腔巨噬细胞泡沫化过程中，磷酸化-NF-κB（p-NF-κB）p65表达增加，与空白对照相比差异明显(p＜0.01)，与C3H/HeJ相比，差异有统计学意义(p＜0.01)。(4) ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导C3H/HeN小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞形成时，TF、MCP-1及TNF-α表达明显增加(p＜0.01)，与C3H/HeJ小鼠相比，差异有统计学意义(p＜0.01）。(5) C3H/HeN小鼠组中，ox-LDL/β2GPI诱导的巨噬细胞TLR4、p-NF-κB、TF、MCP-1及TNF-α表达均显著低于ox-LDL诱导的表达(p＜0.01)。
　　结论:(1) TLR4能够促进ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的小鼠腹腔巨噬细胞的泡沫化，提示TLR4在介导抗磷脂综合征相关的动脉粥样硬化病理进程中发挥重要作用。
　　(2) TLR4/NF-κB信号通路介导ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化过程，进而促进TF、MCP-1及TNF-α等活性分子的表达是其发挥作用的重要途径之一。
　　(3)抑制TLR4的表达及其信号通路的激活可以降低ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化，并降低相关活性分子的表达，提示TLR4/NF-κB可作为预防抗磷脂综合征相关的动脉粥样硬化的靶点。
　　(4)β2GPI在泡沫细胞形成过程中有双重作用，在缺少抗β2GPI抗体情况下可以作为一种抗动脉粥样硬化的蛋白，通过结合ox-LDL而降低细胞泡沫化及相关活性分子的表达;在抗β2GPI抗体存在情况下可以通过促进巨噬细胞对ox-LDL吞噬及相关活性分子的表达，发挥促动脉粥样硬化的作用。

目录

声明

摘要

主要英文缩略词索引

第一章 绪论

1．1 TLR4与ox-LDL

1．1．1 TLR4的结构与作用

1．1．2 TLR4的信号转导和NF-κB

1．1．3 ox-LDL与动脉粥样硬化

1．1．4 TLR4与ox-LDL

1．2 β2GPI

1．2．1 β2GPI的结构与生物学特性

1．2．2 抗β2GPI抗体

1．2．3 β2GPI／抗βGPI抗体复合物和TLR4

1．2．4 ox-LDL／β2GPI／抗β2GPI抗体复合物

1．2．5 β2GPI与动脉粥样硬化

1．3 结语

1．4 本论文研究的目的、方法、实验方案的设计、意义

第二章 材料与方法

2．1 主要材料

2．2 主要试剂

2．3 主要仪器

2．4 研究方法

2．4．1 小鼠腹腔巨噬细胞的提取与培养

2．4．2 油红O泡沫细胞染色及分析

2．4．3 蛋白质印记分析

2．4．4 实时定量PCR(RT-qPCR)分析

2．4．5 TF活性测定

2．4．6 细胞上清TNF-α含量测定

2．4．7 细胞上清MCP-1含量测定

2．4．8 图像采集与统计学分析

第三章 结果

3．1 TLR4在ox-LDL／β2GPI／抗β2GPI抗体复合物诱导小鼠腹腔巨噬细胞向泡沫细胞转化的作用研究

3．1．1 不同浓度的ox-LDL对小鼠腹腔巨噬泡沫细胞形成的影响

3．1．2 TLR4促进ox-LDL／β2GPI／抗β2GPI抗体复合物诱导的巨噬泡沫细胞的形成

3．2 ox-LDL／β2GPI／抗β2GPI抗体复合物诱导C3H／HeN小鼠腹腔泡沫细胞形成过程中促进TLR4表达

3．3 TLR4促进ox-LDL／β2GPI／抗β2GPI抗体复合物诱导小鼠腹腔巨噬细胞NF-κB的活化

3．3．1 ox-LDL／β2GPI／抗β2GPI抗体复合物诱导小鼠巨噬细胞NF-κB活化的时效性

3．3．2 ox-LDL／β2GPI／抗β2GPI抗体复合物诱导小鼠巨噬细胞NF-κB活化的特异性与TLR4关系

3．4 TLR4对ox-LDL／β2GPI／抗β2GPI抗体复合物刺激小鼠腹腔巨噬细胞TF表达的影响

3．5 TLR4促进ox-LDL／β2GPI／抗β2GPI抗体复合物刺激小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α及MCP-1的表达

第四章 讨论

第五章 主要结论与展望

5．1 主要结论

5．2 展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的文章与参加的会议