TLR4/NF-κB通路在oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物诱导小鼠巨噬细胞泡沫化中的作用探讨

摘要

目的:
　　抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome，APS)及系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）等自身免疫性疾病患者体内存在未成熟和加速发展的动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)。研究表明，APS及SLE患者血清中高滴度的氧化性低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，oxLDL）/β2糖蛋白Ⅰ（β-2-glycoproteinⅠ，β2GPI）/抗β2GPI抗体(anti-β2GPI)三者复合物与该类患者体内加速发展的AS高度相关，然而其具体机制不详。
　　本论文重点探讨跨膜蛋白toll样受体4(Toll-like receptor4，TLR4)/核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信号转导通路在oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物诱导BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞转化为泡沫细胞及表达动脉粥样硬化相关分子中的作用。
　　研究方法:
　　(1)油红O染色观察oxLDL或oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物诱导BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞转化为泡沫细胞后细胞内磷脂的聚积，并用异丙醇抽提细胞内油红O，测定该溶液在520 nm的OD值，定量反应细胞内磷脂的聚积。采用TLR4特异性抑制剂TAK-242预处理细胞，观察TLR4是否参与此过程。
　　(2)实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR，RT-qPCR)及流式细胞术分别检测oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物诱导BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化过程中TLR4 mRNA和蛋白的表达情况。
　　(3) Western blotting检测oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物刺激BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化过程中NF-κB p65表达及其磷酸化情况，并用TAK-242预处理细胞，以观察TLR4对NF-κBp65表达及其磷酸化的影响。
　　(4) ELISA检测oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物诱导BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞MCP-1的表达，并采用TAK-242和PDTC（NF-κB抑制剂）预处理巨噬细胞，以分别观察TLR4和NF-κB对三者复合物刺激小鼠腹腔巨噬细胞表达MCP-1的干预作用。
　　(5) RT-qPCR和 TF活性试剂盒分别检测oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物刺激BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞TF mRNA表达和活性变化，并用TAK-242和PDTC预处理巨噬细胞，以分别观察TLR4和NF-κB对此过程的干预作用。
　　研究结果:
　　(1)oxLDL(10μg/mL)/β2GPI(100μg/mL)/anti-β2GPI(100μg/mL)复合物较oxLDL(10μg/mL)单独刺激能诱导更多的BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞转化为泡沫细胞，且TLR4抑制剂TAK-242(5μM)能明显抑制oxLDL或oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物诱导的泡沫细胞形成。
　　(2)oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物能显著增加BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞转化为泡沫细胞过程中TLR4 mRNA和蛋白的表达，与对照组相比差异显著(p＜0.05)。
　　(3)oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物能显著增加BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化过程中NF-κB p65的磷酸化水平，而TAK-242能明显抑制这三者复合物诱导的NF-κB p65的磷酸化。
　　(4)oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物能显著增加BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞MCP-1的分泌，而TAK-242和PDTC(20μM)可显著抑制这种作用。
　　(5)oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物能显著增加BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞TF mRNA水平和活性，该效应可被TAK-242和PDTC显著抑制。
　　结论:
　　(1)与oxLDL单独刺激相比，β2GPI、anti-β2GPI和oxLDL同时刺激时，BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞能够摄取更多的oxLDL及表达更高水平的AS相关效应分子MCP-1和TF，这可能是APS患者体内AS加速发展的重要机制之一。
　　(2) oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物诱导BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化过程中，TLR4及其下游信号分子NF-κB被诱导表达增加，阻断TLR4可显著但不完全减少泡沫细胞形成和NF-κB磷酸化，提示TLR4/NF-κB信号通路部分介导了三者复合物诱导的泡沫细胞形成。
　　(3) TLR4和NF-κB的抑制剂能够降氐oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物刺激BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞MCP-1和TF的表达，这为APS患者体内AS加速发展的防治提供了新思路。

目录

声明

摘要

主要英文缩略词索引

第一章 绪论

1．1 oxLDL／β2GPI／anti-β2GPI复合物

1．1．1 LDL及oxLDL

1．1．2 β2GPI

1．1．3 Anti-β2GPI

1．1．4 oxLDL／β2GPI／anti-β2GPI

1．2 TLR4／NF-κB信号通路

1．2．1 TLRs的概况

1．2．2 TLR4的配体

1．2．3 TLR4／NF-κB信号转导机制

1．3 TLR4／NF-κB信号通路与疾病

1．3．1 TLR4／NF-κB信号通路与抗磷脂综合征

1．3．2 TLR4／NF-κB信号通路与动脉粥样硬化

1．4 结语

第二章 研究内容与方案及研究意义

2．1 研究内容

2．2 研究方法

2．3 实验的设计方案

2．4 研究意义

第三章 TLR4／NF-κB信号通路在oxLDL／β2GPI／anti-β2GPI复合物诱导小鼠巨噬细胞泡沫化中的作用

3．1 材料

3．1．1 主要试剂

3．1．2 其它试剂

3．1．3 主要溶液

3．1．4 主要仪器

3．2 方法

3．2．1 BALB／c小鼠腹腔巨噬细胞的提取及培养

3．2．2 细胞总RNA的提取和逆转录

3．2．3 RT-qPCR分析

3．2．4 细胞总蛋白的提取及Western蛋白印迹

3．2．5 TF活性检测

3．2．6 MCP-1含量的测定

3．2．7 油红O染色

3．2．8 定量分析泡沫细胞的形成

3．2．9 流式细胞术检测TLR4

3．2．10 统计学分析

3．3 结果

3．3．1 oxLDL／β2GPI／anti-β2GPI复合物诱导小鼠巨噬细胞转化为泡沫细胞及TLR4在其中的作用

3．3．2 oxLDL／β2GPI／anti-β2GPI复合物诱导小鼠巨噬细胞泡沫化过程中TLR4的表达情况

3．3．3 TLR4对oxLDL／β2GPI／anti-β2GPI复合物诱导小鼠巨噬细胞泡沫化过程中NF-κB p65磷酸化的影响

3．3．4 TLR4／NF-κB信号转导通路在oxLDL／β2GPI／anti-β2GPI复合物诱导小鼠巨噬细胞表达MCP-1中的作用

3．3．5 TLR4／NF-κB信号转导通路在oxLDL／β2GPI／anti-β2GPI复合物诱导小鼠巨噬细胞表达TF中的作用

3．4 讨论

第四章 主要结论及展望

4．1 主要结论

4．2 展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的文章与参加的会议