基于壳寡糖的卟啉类光敏剂载体的制备及性能研究

摘要

光动力疗法(Photodynamic therapy, PDT)是一种利用光敏剂分子在可见光照射下使其结合组织氧产生单线态氧，从而杀伤癌细胞的抗癌新方法。然而，大多合成类光敏剂因较差的水溶性和生物相容性限制了进一步的临床应用。聚合物纳米胶束给药系统可以有效改善这一问题。壳寡糖(Chitosan oligosaccharide，COS)是一种分子量低、水溶性好、生物活性高的壳聚糖解聚产物，它不仅保留了高分子壳聚糖的良好生物相容性和生物可降解性，而且还具有较好的溶解性和易被生物体吸收等独特功能，因而日益成为一种理想的药物载体原材料。
　　本文通过对壳寡糖进行疏水改性和功能化修饰，以期得到一种安全、高效，具有主动靶向和光敏作用的药物载体。具体内容如下:
　　1:以水溶性壳寡糖为原料，通过亚油酸疏水改性，得到不同取代度的亚油酰化壳寡糖(LCOS)，再经叶酸靶向修饰，得到靶向两亲性壳寡糖衍生物(FA-LCOS)。IR和1HNMR结果表明通过酰胺键成功将亚油酸和叶酸分子连接到壳寡糖上;由GPC和氨基数测定得LCOS的3种取代度分别为15.0％、25.0％和30.0％，并且LCOS上均成功地接枝了2分子的叶酸;经表面张力法与芘荧光探针法分析了其在水溶液中的胶束化行为，其较低的临界胶束浓度(1.47×10-3 mg/mL)使其在水溶液中自组装形成球形纳米胶束，粒径分布较窄(70～100 nm);MTT实验表明其对HeLa细胞无明显的细胞毒性，初步说明其生物相容性良好。
　　2:在pH=7.4的PBS缓冲溶液中，制备了FA-LCOS负载四苯基卟啉(TPP)的载药胶束，其负载率高达81.7％;紫外-可见光谱表明TPP成功分散进入FA-LCOS纳米胶束中;该载药胶束较空白胶束具有较好的球形形貌和较窄的粒径分布(60～100 nm);通过等温滴定微量热法(ITC)测得该负载过程的热力学参数:ΔH=20.612 kJ/mol，ΔS=173.719 J/mol/K，ΔG=-31.156 kJ/mol，表明该负载过程为吸热的熵驱动自发过程，主要驱动力为疏水作用，FA-LCOS纳米胶束与TPP两者间结合较为牢固(结合常数Ka=2.87×106 L/mol)，有望实现对TPP的缓慢释放;该载药胶束的体外释放性能结果表明，不同介质中(pH=7.4或6.5的PBS缓冲液)，TPP从载药胶束中释放均较缓慢，未出现突释现象，其累积释放率依次为58.1％和65.3％，具有良好的缓释性能;MTT实验初步表明该载药胶束具有良好的生物相容性，并且在可见光照射下对HeLa细胞具有明显的细胞光毒性;细胞摄取实验表明，该载药胶束使HeLa细胞对TPP的摄入量显著增加;体外靶向性评价表明，该载药胶束通过叶酸介导内吞方式进入HeLa细胞，对HeLa细胞具有良好的主动靶向性。
　　3:将水不溶性光敏剂分子TPP通过酰胺键连接到靶向两亲性壳寡糖衍生物(FA-LCOS)上，得到一种光敏功能化衍生物(TPP-FA-LCOS)，同时实现光敏剂的胶束内在化，采用荧光光谱和紫外-可见光谱对其光化学性质进行了初步探索。结果表明，通过酰胺键成功地将TPP接枝到FA-LCOS上，TPP-FA-LCOS具有较好的光学性质，在水溶液中的较好的分散性，大大地削弱了TPP分子间的自淬灭效应，提高了其荧光量子产率（Φ=0.21）;其较低的临界胶束浓度(2.5×10-3 mg/mL)使其在水溶液中自组装形成球形纳米胶束，具有较窄的粒径分布(70～120 nm); MTT实验初步表明TPP-FA-LCOS具有良好的生物相容性，在可见光照射下对HeLa细胞具有明显的细胞光毒性。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 光动力疗法及光敏性抗癌药物的研究

1．1．1 光动力治疗的机理

1．1．2 光动力疗法的特性

1．1．3 光敏剂

1．1．4 光化学内化

1．2 聚合物纳米胶束

1．2．1 聚合物胶束的特性

1．2．2 细胞摄取机理

1．2．3 载体材料

1．3 壳聚糖及其两亲性衍生物

1．3．1 壳聚糖

1．3．2 壳聚糖的两亲性化学修饰方法

1．3．3 两亲性壳聚糖衍生物纳米胶束的应用研究

1．4 论文选题依据及研究意义

第二章 靶向两亲性壳寡糖衍生物的合成及其性能

2．1 实验材料

2．1．1 实验主要试剂

2．1．2 实验主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 靶向两亲性壳寡糖衍生物的合成

2．2．2 结构表征

2．2．3 溶解性的测定

2．2．4 胶束化行为的测定

2．2．5 自组装胶束的形貌及粒径分布的测定

2．2．6 细胞毒性实验

2．3 结果与讨论

2．3．1 结构表征

2．3．2 溶解性分析

2．3．3 胶束化行为分析

2．3．4 自组装纳米胶束的形貌及其粒径分布

2．3．5 细胞毒性分析

2．4 本章小结

第三章 负载四苯基卟啉的载药胶束的制备及其性能

3．1 实验材料

3．1．1 实验主要试剂

3．1．2 实验主要仪器

3．2 实验方法

3．2．1 四苯基卟啉的合成

3．2．2 负载光敏剂的靶向两亲性壳寡糖衍生物纳米胶束的制备

3．2．3 紫外-可见光谱的测定

3．2．4 形貌及粒径分布的测定

3．2．5 载药胶束的稳定性评价及其负载率

3．2．6 等温滴定微量热(ITC)实验

3．2．7 载药胶束体外释药性能测试

3．2．8 细胞毒性实验

3．2．9 细胞摄取实验

3．2．10 主动靶向可行性评价

3．3 结果与讨论

3．3．1 紫外-可见光谱分析

3．3．2 载药胶束的形貌及其粒径分布

3．3．3 载药胶束的稳定性评价及其负载率

3．3．4 FA-LCOS纳米胶束与TPP的热力学作用分析

3．3．5 体外释药性能分析

3．3．6 细胞毒性分析

3．3．7 细胞摄取分析

3．3．8 体外靶向性评价

3．4 本章小结

第四章 光敏功能化的壳寡糖衍生物的合成及其性能

4．1 实验材料

4．1．1 实验主要试剂

4．1．2 实验主要仪器

4．2 实验方法

4．2．1 5-(4-羧基苯基)-10，15，20-三苯基卟啉的合成

4．2．2 光敏功能化的壳寡糖衍生物的合成

4．2．3 结构表征

4．2．4 溶解性的测定

4．2．5 临界胶束浓度的测定

4．2．6 荧光光谱的测定及其荧光量子产率

4．2．7 自组装胶束的形貌及其粒径分布的测定

4．2．8 细胞毒性实验

4．3 结果与讨论

4．3．1 结构表征

4．3．2 溶解性分析

4．3．3 临界胶束浓度分析

4．3．4 荧光光谱及其荧光量子产率的分析

4．3．5 自组装胶束形貌及其粒径分布分析

4．3．6 细胞毒性分析

4．4 本章小结

第五章 论文总结与展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文