CAC小鼠发病过程中IL-17/Th17细胞对MDSCs的作用

摘要

目的:利用肠炎相关性结肠癌(colitis associated cancer，CAC)小鼠模型，研究从慢性炎症到肠癌的发展过程中IL-17/Th17细胞和MDSCs(myeloid-derived suppressor cells)的变化情况;体外研究IL-17对G-MDSCs（granulocytic MDSCs）功能的影响。
　　方法:
　　(1)给予小鼠单次小剂量腹腔注射氧化偶氮甲烷(12.5mg/kg)，联合三循环2％葡聚糖硫酸钠自由饮用方法建立CAC小鼠模型。
　　(2)通过流式细胞术检测CAC各阶段小鼠体内Th17细胞的变化，qRT-PCR检测IL-17、RORγt mRNA的相对表达水平;同时通过流式细胞术检测CAC小鼠各阶段MDSCs的变化。对CAC术期小鼠结肠组织切片进行免疫荧光染色，利用激光共聚焦显微镜观察组织中Th17细胞和MDSCs的浸润情况。
　　(3) ELISA检测CAC模型小鼠早期结肠中IL-17表达水平;qRT-PCR检测CAC造模早期小鼠结肠中CXCL1、CXCL5 mRNA的相对表达水平。
　　(4)体外利用IL-17刺激G-MDSCs，台盼蓝染色后进行活细胞计数;用比色法测定培养上清中精氨酸酶活性;采用[3H]TdR掺入实验检测G-MDSCs对T细胞的抑制能力。
　　结果:
　　(1)病理切片显示造模组小鼠结肠黏膜层及黏膜下层有广泛的炎症细胞浸润，癌组织侵入粘膜层，腺体组织结构紊乱、破坏，出现腺管样结构，具有组织异型性;在造模组小鼠结肠远端出现肉眼可见的肿瘤，这显示CAC模型成功建立。
　　(2)经流式细胞术检测发现，与对照组相比，Th17细胞在造模第二个循环明显增多，MDSCs在造模的第三个循环明显增多。同时，qRT-PCR检测显示IL-17和RORγt的mRNA水平也随着病情的发展逐步升高，与流式结果相一致。另外，通过免疫荧光染色更为直观地发现结肠组织中有Th17细胞及MDSCs的浸润。
　　(3)与对照组相比，在CAC模型的早期小鼠肠组织中即出现IL-17水平的升高，且同时也发现造模早期小鼠结肠中CXCL1和CXCL5 mRNA相对表达明显升高。
　　(4)经IL-17刺激后，G-MDSCs的体外存活数目增加;IL-17处理后的G-MDSCs抑制T细胞增殖的能力明显增强，精氨酸酶的活性升高。
　　结论:
　　(1)在肠炎发展到肠癌的进程中，首先出现IL-17增高和Th17细胞增多现象，随后Th17细胞和MDSCs的比例不断升高。此外，在早期CAC小鼠结肠组织中CXCL1、CXCL5的相对表达也明显增加。结果提示IL-17可促进局部组织表达高水平趋化因子，招募MDSCs至局部组织，促进肿瘤的发展。
　　(2)发现体外IL-17可增强G-MDSCs的免疫抑制功能，有利于G-MDSCs的存活。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 MDSCs(myeloid-derived suppressor cells)

1．1．1 MDSCs的来源和分群

1．1．2 MDSCs的扩增和活化

1．1．3 MDSCs的免疫抑制功能

1．1．4 肿瘤来源的因子支持MDSCs产生、扩增并增强其功能

1．1．5 MDSCs与疾病

1．2 IL-17

1．2．IL-17分泌的调节

1．2．2 IL-17促进肿瘤发展的作用和机制

1．2．3 IL-17促进结直肠癌(colorectal cancer，CRC)的发展

1．3 本研究的目的、方法、实验设计及意义

1．3．1 研究目的

1．3．2 研究方法

1．3．3 实验设计

1．3．4 研究意义

第二章 氧化偶氮甲烷和葡聚糖硫酸钠致肠炎相关性结肠癌小鼠模型的建立

2．1 材料

2．1．1 实验小鼠

2．1．2 主要试剂

2．2 方法

2．2．1 动物实验分组

2．2．2．结肠炎临床观察

2．2．3．病理检查

2．2．4．统计学方法

2．3 实验结果

2．3．1 小鼠粪便隐血及体重的观察

2．3．2 造模小鼠结肠，脾脏及肠系膜淋巴结的大体观察

2．3．3 组织学改变

2．4 讨论

第三章 Th17细胞和MDSCs在CAC模型进程中的变化

3．1 实验仪器和材料

3．1．1 实验仪器

3．1．2 材料和试剂

3．1．3 实验小鼠

3．1．4 主要溶液配制

3．2 实验方法

3．2．1 小鼠脾脏细胞的分离

3．2．2 小鼠结肠组织消化分离

3．2．3 流式细胞术(FCM)检测各阶段CAC模型小鼠脾脏、结肠中MDSCs

3．2．4 流式细胞术检测(FCM)各阶段CAC模型小鼠脾脏、肠系膜淋巴结中Th17细胞

3．2．5 荧光定量PCR检测CAC小鼠脾脏，肠系膜淋巴结中IL-17、RORγt mRNA的相对表达

3．2．6 小鼠结肠组织切片免疫荧光染色

3．2．7 共聚焦显微镜观察CAC小鼠造模晚期结肠组织中MDSCs和Th17细胞

3．2．8 小鼠结肠组织裂解液的制备

3．2．9 ELISA检测结肠组织中的IL-17水平

3．2．10 统计学分析

3．3 实验结果

3．3．1 在CAC发展进程中小鼠脾脏、肠系膜淋巴结中Th17细胞比例不断增加

3．3．2 在CAC发展进程中小鼠脾脏、结肠组织中MDSCs比例不断增加

3．3．3 CAC小鼠结肠中出现MDSCs、Th17细胞的浸润

3．3．4 CAC小鼠模型早期结肠组织中IL-17的水平升高

3．3．5 CAC小鼠造模早期结肠局部CXCL1、CXCL5 mRNA相对表达水平

3．4 讨论

第四章 IL-17对G-MDSC数目及功能的影响

4．1 实验材料

4．1．1 实验仪器

4．1．2 材料

4．1．3 试剂

4．1．4 实验小鼠

4．1．5 主要溶液配制

4．2 实验方法

4．2．1 Lewis荷瘤小鼠模型的建立

4．2．2 磁珠分选小鼠CD11b+LY6G+LY6ClowG-MDSCs

4．2．3 磁珠分选小鼠CD4+T细胞

4．2．4 G-MDSCs免疫抑制功能试验

4．2．5 精氨酸酶(Arg-1)活性测定

4．2．6 台盼蓝染色活细胞计数

4．2．7 统计学分析

4．3 实验结果

4．3．1 IL-17有利于G-MDSCs的体外存活

4．3．2 IL-17增强G-MDSCs的免疫抑制功能

4．4 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的文章