烟曲霉二肽基肽酶V肽段抗体检测方法建立及应用

摘要

曲霉是一类经呼吸道传播的常见条件致病性真菌，其中以烟曲霉最为常见，其感染引起的侵袭性曲霉菌病（IA）在免疫抑制和恶性肿瘤患者中的发病率和死亡率逐年上升，其中侵袭性肺曲霉病若不及时治疗，死亡率极高。但是，由于IA的临床表现多不具有典型性，曲霉培养敏感性很低，病理学检查不易常规开展，循环中真菌抗原检测法的敏感性和特异性还不足满足临床需求，因此，研究开发快速、无创、敏感性强、特异性高的实验室诊断方法具有重要意义。本实验室前期研究发现，IA患者血清中针对曲霉优势抗原的抗体水平升高，检测这些特异性抗体，有助于IA的诊断。其中二肽基肽酶V(DPPV)是优势抗原之一，其特异性抗体对IA诊断的价值，尚需探讨。
　　研究目的:
　　选择抗原性强的烟曲霉DPPV肽段进行原核表达;建立检测人血清中抗DPPV肽段IgG类抗体的间接ELISA法;评估其在IA中的早期诊断价值。
　　研究方法:
　　对烟曲霉DPPV全长序列进行生物信息学分析，选取与人和其他生物同源性低、抗原决定簇密集的区域分段表达。分别采用生物合成和PCR扩增技术，获得DPPV19～144、145～446及19～447位氨基酸肽段的编码序列。构建重组表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌，IPTG诱导表达获得重组肽段DPPV19-144p、DPPV145-447p及DPPV19-447p;纯化后三个DPPV重组肽段与确诊IA患者血清进行Westernblot分析，筛选抗原性最强的DPPV19-447p肽段作为包被抗原，建立抗DPPV抗体的间接ELISA法;评估该检测方法对侵袭性曲霉病（IA）的诊断价值。
　　研究结果:
　　(1)烟曲霉DPPV同源性分析显示与人源和其他病原菌蛋白的同源性低，结合结构域和抗原决定簇密集分布区域，我们选择对烟曲霉19～144、145～447和19～447位氨基酸肽段进行克隆表达基因进行克隆。构建了相应的工程表达菌株并诱导表达，获得带有His标签的DPPV19-144p、DPPV145-447p及DPPV19-447p肽段，分子量分别约为15kD、35.4kD和47kD。
　　(2)经Western blot鉴定表明烟曲霉DPPV19-144p、DPPV145-447p及DPPV19-447p重组肽段均可与IA患者血清发生特异性反应，其中DPPV19-447p抗原性最强。以重组烟曲霉DPPV19447p肽段抗原作为建立的的ELISA方法批内变异系数（CV)均值为4.1％和8.6％，批间CV的均值分别为7.1％和10.9％，阻断试验阻断率＞90％，显示该方法稳定性和特异性良好。
　　(3)以该法检测IA患者组、非IA患者组和健康组血清抗DPPV19-447p抗体检测结果显示，选择cut off值为0.542时，该方法对IA诊断的敏感性66.7％，特异性90.7％。在非中性粒细胞缺乏的IA患者抗DPPV肽段抗体阳性率(75.3％，55/73)高于中性粒细胞缺乏的IA患者(46.88％，15/32)，P＜0.05。
　　结论:
　　成功筛选表达了抗原性强的烟曲霉二肽基肽酶重组肽段，建立了检测抗DPPV19-447p抗体的ELISA法，证明DPPV19-447p具有作为IA早期诊断标志物的潜力。

目录

声明

摘要

主要英文缩略词索引

第一章 绪论

1．1 侵袭性真菌感染诊断现状

1．1．1 现有侵袭性烟曲霉感染诊断方法

1．2 烟曲霉侵袭感染相关的优势抗原航体研究现状

1．2．1 烟曲霉侵袭感染相关的优势抗原航体研究现状

1．3 烟曲霉二肽基肽酶研究进展

第二章 烟曲霉二肽基肽酶的生物信息学分析及重组肽段的克隆表达

2．1 实验材料

2．1．1 质粒与菌株

2．1．2 工具酶及主要试剂

2．1．3 血清来源

2．1．4 主要溶液

2．1．5 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 烟曲霉DPPV的生物信息学分析

2．2．2 烟曲霉二肽基肽酶cDNA的获得

2．2．3 引物设计与序列合成

2．2．4 克隆载体的构建

2．2．4 表达载体的构建

2．2．5 重组蛋白的诱导表达

2．2．6 重组肽段的纯化及鉴定

2．3 结果

2．3．1 烟曲霉DPPV的生物信息学分析结果

2．3．2 烟曲霉DPPV肽段基因的PCR扩增

2．3．3 重组克隆载体鉴定

2．3．4 表达质粒的的鉴定

2．3．5 重组蛋白的诱导表达及纯化

2．3．6 重组肽段的鉴定

2．3．7 重组蛋白的纯化和抗原性分析

2．4 讨论

第三章 检测烟曲霉二肽基肽酶肽段抗体的ELISA方法建立

3．1 实验材料

3．1．1 血清样本

3．1．2 主要试剂及仪器

3．2 实验方法

3．2．1 DPPV19-447p重组蛋白质的制备

3．2．2 抗DPPV19-447p抗体间接ELISA方法建立

3．2．3 抗DPPV19-447p抗体检测间接ELISA法的优化

3．2．4 抗DPPV19-447p抗体检测间接ELISA法的方法学考核

3．3 实验结果

3．3．1 抗DPPV19-447p抗体检测间接ELISA方法条件的优化

3．3．2 ELISA方法学考核

3．3．3 IA兔模型血清测定结果

3．4 讨论

第四章 ELISA检测抗烟曲霉二肽基肽酶肽段抗体在IA患者中的应用

4．1 实验材料

4．1．1 血清标本来源

4．1．2 主要试剂及仪器

4．2 实验方法

4．2．1 DPPV19-447p重组肽段的制备

4．2．2 人血清抗DPPV19-447p抗体检测间接ELISA法及cut-off值的确定

4．2．3 统计学分析

4．3 结果

4．3．1 间接ELISA法的反应条件及cut-off值

4．3．2 患者血清抗DPPV抗体测定结果

4．3．3 血清抗DPPV水平与病程的关系

4．3．4 抗原抗体联合诊断意义的评价

4．4 讨论

第五章 主要结论及展望

8．1 主要结论

8．2 展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的文章与参加的学术会议

附录

附录A 烟曲霉DPPV同源性分析结果

附录B 测序图

附录C IA患者临床特征及血清anti-DPPV、anti-TR及GM检测结果