胰腺癌细胞中MeCP2通过结合LIN28基因的甲基化CpG岛而调控其表达

摘要

研究目的:
　　1.研究LIN28基因在三种人胰腺癌细胞株中的表达情况及各细胞增殖和迁移能力的差异;
　　2.研究三种人胰腺癌细胞株中LIN28基因CpG岛的DNA甲基化状态;
　　3.探索甲基化结合蛋白在三种人胰腺癌细胞株中的LIN28基因CpG岛DNA甲基化中的作用;
　　4.探索LIN28基因的表达对人胰腺癌细胞株增殖及迁移能力的影响;
　　研究方法:
　　1.检测LIN28基因在三种人胰腺癌细胞株中的表达情况及各细胞株的增殖和迁移率
　　1.1在三株人胰腺癌细胞中检测LIN28的表达
　　培养低分化的胰腺癌细胞株PANC1、中分化的细胞SW1990和PaTu8988，提取细胞内总RNA，定量PCR法检测LIN28基因的mRNA表达水平;提取细胞内总蛋白，Western Blot法检测LIN28基因的蛋白表达水平。
　　1.2检测胰腺癌细胞株的增殖能力
　　培养低分化的胰腺癌细胞株PANC1、中分化的细胞SW1990和PaTu8988，采用CCK8法检测上述胰腺癌细胞株的细胞增殖速率。
　　1.3检测胰腺癌细胞株的迁移能力
　　培养低分化的胰腺癌细胞株PANC1、中分化的细胞SW1990和PaTu8988，采用Transwell小室法检测上述胰腺癌细胞株的细胞迁移速率。
　　2.检测三种胰腺癌细胞株中LIN28基因CpG岛的甲基化状态
　　2.1亚硫酸盐修饰后测序法检测LIN28基因CpG岛的甲基化状态
　　培养胰腺癌细胞株PANC1、SW1990和PaTu8988，提取基因组DNA，采用亚硫酸盐修饰后测序法检测上述细胞中LIN28基因CpG岛的甲基化状态。
　　2.2检测甲基化酶抑制剂5-Aza-CdR处理对胰腺癌细胞株中LIN28基因表达的影响
　　培养胰腺癌细胞株PANC1、SW1990和PaTu8988，5-Aza-CdR处理72h，提取总RNA，定量PCR法检测LIN28基因mRNA水平表达的变化;提取总蛋白，Western Blot法检测LIN28基因蛋白水平表达的变化。
　　3.初步探索甲基化结合蛋白在胰腺癌细胞中LIN28基因CpG岛甲基化中的作用
　　3.1检测甲基化结合蛋白在胰腺癌细胞中的表达情况
　　培养胰腺癌细胞株PANC1、SW1990和PaTu8988，Western Blot法检测各细胞中MeCP2、MBD2、MBD3蛋白的表达。
　　3.2检测甲基化结合蛋白对LIN28基因CpG岛的转录抑制
　　采用染色质共沉淀法检测MeCP2和MBD3与LIN28基因CpG岛的结合能力。将干扰质粒pLKO.1-puro-shMeCP2和pLKO.1-puro-shMBD3分别转染至PANC1和PaTu8988细胞中，鉴定质粒的干扰效果后分别运用定量PCR法和Western Blot法检测LIN28基因在mRNA水平和蛋白水平的表达变化。
　　4.探索LIN28基因的表达对胰腺癌细胞增殖和迁移能力的影响
　　4.1鉴定LIN28基因的干扰效果
　　将LIN28干扰质粒shLIN28及其对照质粒sheGFP分别转染入PANC1细胞中，分别采用定量PCR法和Western Blot法检测LIN28基因的干扰效果。
　　4.2检测下调LIN28基因对胰腺癌细胞增殖和迁移能力的影响
　　将LIN28干扰质粒shLIN28及其对照质粒sheGFP分别转染入PANC1细胞中，分别采用CCK8法和Transwell小室法检测其增殖率和迁移率的变化。
　　4.3鉴定LIN28基因的过表达效果
　　将LIN28过表达质粒3×Flag-LIN28及其对照质粒3×Flag-vector分别转染入PaTu8988和SW1990细胞中，分别采用定量PCR法和Western Blot法检测LIN28的过表达效果。
　　4.4检测过表达LIN28对胰腺癌细胞增殖和迁移能力的影响
　　将LIN28过表达质粒3×Flag-LIN28及其对照质粒3×Flag-vector分别转染入PaTu8988和SW1990细胞中，分别采用CCK8法和Transwell法检测其增殖率和迁移率的变化。
　　研究结果:
　　1.胰腺癌细胞株中LIN28基因的表达与其增殖和迁移率有关
　　1.1在胰腺癌细胞株中检测LIN28的表达，SW1990和PaTu8988细胞中LIN28的表达量显著低于PANC1细胞
　　在胰腺癌细胞株PANC1、SW1990和PaTu8988中检测LIN28的表达，发现PANC1细胞中LIN28基因在mRNA水平和蛋白水平的表达量都明显高于SW1990和PaTu8988细胞，并且SW1990和PaTu8988细胞中LIN28的表达量极低。
　　1.2在胰腺癌细胞株中检测各细胞的增殖和迁移率，PANC1细胞明显高于SW1990和PaTu8988细胞
　　比较胰腺癌细胞株PANC1、SW1990和PaTu8988的增殖和迁移率，发现PANC1细胞的增殖和迁移率均显著高于SW1990和PaTu8988细胞。因此，推测LIN28的表达量可能与胰腺癌细胞的恶性程度有关。
　　2.胰腺癌细胞株中LIN28基因CpG岛的高甲基化抑制其转录
　　2.1胰腺癌细胞株中LIN28基因CpG岛呈高甲基化状态
　　对胰腺癌细胞株PANC1、SW1990和PaTu8988中的LIN28基因的两段连续的CpG岛分别进行亚硫酸盐修饰后测序发现，上述细胞中LIN28基因的两段CpG岛均呈高甲基化状态。PANC1、SW1990和PaTu8988细胞中第一段CpG岛的甲基化效率分别为67.69％±2.5％，86.15％±3.5％和98.46％±4％;而相应细胞第二段CpG岛的甲基化效率分别为74.60％±3％，83.33％±1.5％和92.85％±2.5％。
　　2.2胰腺癌细胞株中的LIN28基因在甲基化酶抑制剂5-Aza-CdR处理下转录激活
　　在5-Aza-CdR作用下，胰腺癌细胞株PANC1、SW1990和PaTu8988中的LIN28基因在mRNA水平和蛋白水平的表达量均显著提高。
　　3.甲基化结合蛋白MeCP2调控LIN28基因的转录
　　3.1 MeCP2在胰腺癌细胞中的表达量较高
　　在胰腺癌细胞株PANC1、SW1990和PaTu8988中检测甲基化结合蛋白MeCP2、MBD2和MBD3的表达，其中MeCP2和MBD3在上述各细胞株中的表达较高，而MBD2的表达量很低。而MBD3在DNA甲基化中无抑制作用，因此推测，MeCP2可能在LIN28基因的转录抑制过程中发挥重要的功能。
　　3.2 MeCP2特异性地结合甲基化的LIN28基因CpG岛
　　以LIN28基因第二段CpG岛为模板，结合染色质共沉淀法与普通PCR或定量PCR法，发现MeCP2能特异性地结合到甲基化的LIN28基因CpG岛。在PANC1和PaTu8988细胞中下调MeCP2后，LIN28基因在mRNA水平和蛋白水平的表达量均有所提高，验证了MeCP2对LIN28基因的转录抑制。
　　4.LIN28基因的表达量与胰腺癌细胞的增殖和迁移能力有关
　　4.1 LIN28干扰质粒能显著下调PANC1细胞中LIN28的表达
　　在PANC1细胞中转染LIN28干扰质粒后，LIN28在mRNA和蛋白水平的表达量较对照组均明显下降。
　　4.2下调LIN28明显抑制PANC1细胞的增殖和迁移能力
　　下调LIN28的表达后，PANC1细胞的增殖率和迁移率均显著下降。
　　4.3 LIN28过表达质粒能显著上调SW1990和PaTu8988细胞中LIN28的表达
　　在SW1990和PaTu8988细胞中转染LIN28过表达质粒后，LIN28在mRNA水平的表达量较对照组明显增高。实验组Flag-LIN28融合蛋白检测阳性，而对照组阴性，提示LIN28过表达质粒成功转染入SW1990和PaTu8988细胞中。
　　4.4上调LIN28显著增强SW1990和PaTu8988细胞的增殖和迁移能力
　　上调LIN28的表达后，SW1990和PaTu8988细胞的增殖率和迁移率均显著增高。
　　研究结论:
　　1.LIN28表达于低分化的胰腺癌细胞株PANC1中，而在中分化的SW1990和PaTu8988细胞中的表达量极低。
　　2.胰腺癌细胞株PANC1、SW1990和PaTu8988中LIN28基因CpG岛的高甲基化导致其转录抑制，而PANC1细胞的甲基化效率明显低于SW1990和PaTu8988细胞。
　　3.甲基化结合蛋白MeCP2调控胰腺癌细胞中LIN28基因的表达。
　　4.LIN28基因的表达量与胰腺癌细胞的增殖和迁移能力密切相关。

目录

声明

摘要

英文缩略语表

第一章 绪论

1．1 研究背景

1．1．1 胰腺癌的研究进展

1．1．2 LIN28基因的研究进展

1．2 本研究的目的意义、内容、技术路线

第二章 LIN28基因与胰腺癌细胞生物学行为的相关性

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．1．3 统计学分析

2．2 结果

2．2．1 在胰腺癌细胞株中检测LIN28的表达，SW1990和PaTu8988细胞显著低于PANC1细胞

2．2．2 比较胰腺癌细胞株的迁移率，PANC1细胞显著高于SW1990和PaTu8988细胞

2．2．3 比较胰腺癌细胞株的增殖率，PANC1细胞显著高于SW1990和PaTu8988细胞

2．3 讨论

第三章 胰腺癌细胞株中LIN28基因CpG岛的高甲基化抑制其转录

3．1 材料和方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．1．3 统计学分析

3．2 结果

3．2．1 LIN28基因启动子附近区域存在两段CpG岛

3．2．2 胰腺癌细胞株中LIN28基因中的两段CpG岛均呈高甲基化状态

3．2．3 5-Aza-CdR激活LIN28的表达

3．3 讨论

第四章 甲基化结合蛋白抑制胰腺癌细胞中LIN28基因的转录

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 方法

4．1．3 统计学处理

4．2 结果

4．2．1 检测三种胰腺癌细胞株中MeCPs的表达

4．2．2 检测MeCPs与LIN28基因CpG岛的结合情况

4．2．3 MeCP2调控LIN28基因的转录抑制

4．3 讨论

第五章 LIN28基因对胰腺癌细胞株增殖和迁移的影响

5．1 材料与方法

5．1．1 材料

5．1．2 方法

5．1．3 统计学处理

5．2 结果

5．2．1 在PANC1细胞中鉴定LIN28基因的干扰效果

5．2．2 检测下调LIN28对PANC1细胞增殖和迁移能力的影响

5．2．3 在PaTu8988和SW1990细胞中鉴定LIN28的过表达效果

5．2．4 过表达LIN28对SW1990和PaTu8988细胞增殖和迁移能力的影响

5．3 讨论

工作总结和展望

1．工作总结

2．展望

参考文献

RNA结合蛋白LIN28的研究进展

在校期间发表论文

致谢