杆状病毒系统表达EV71 VP1蛋白及其在ELISPOT检验 的应用

摘要

目的:应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在sf9昆虫细胞中表达EV71 VP1蛋白，用表达纯化的VP1蛋白作为包被抗原建立ELISPOT检测EV71感染者外周血抗VP1抗体分泌细胞的方法，并评价该方法在检测EV71感染诊断中的应用价值。
　　方法:(1)利用RT-PCR技术从EV71基因组扩增VP1基因。将VP1基因插入到供体质粒pFastBac1中，构建重组质粒pFastBac1-VP1，再转入E.coliDH5 a感受态细胞进行扩增。然后提取重组质粒pFastBac1-VP1，将其转入DH10BacTM（含有杆状病毒质粒和辅助质粒）感受态细胞，通过转座作用将目的基因VP1整合到杆状病毒质粒中，再通过抗性和蓝白斑筛选出重组杆状病毒质粒Bacmid-VP1，提取重组的杆状病毒质粒，以M13通用引物进行PCR鉴定。
　　(2)采用脂质体Cellfectin Reagent将鉴定正确的重组杆状病毒质粒Bacmid-VP1转染sf9细胞，显微镜观察细胞变化。收获P1代病毒，用P1代病毒感染sf9细胞，观察细胞病变效应。PCR鉴定目的基因是否整合到杆状病毒质粒中。
　　(3)通过SDS-PAGE及Western blot法鉴定目的蛋白的表达。经镍离子亲和层析，纯化VP1蛋白，并进行浓度及纯度测定。
　　(4)用纯化的VP1蛋白作为包被抗原，建立ELISPOT检测方法，优化实验方案，包括最佳蛋白包被浓度、细胞浓度、HRP标记抗体工作浓度等。
　　(5)应用ELISPOT方法检测EV71感染者外周血抗VP1抗体分泌细胞，评估重组VP1蛋白在检测EV71感染中的应用价值。
　　结果:(1)RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，成功获得VP1目的基因。构建重组质粒pFastBac1-VP1转化DH10BacTM感受态细胞，阳性Bacmid-VP1重组子经M13通用引物PCR验证获取3227 bp大小的目的片段，与理论大小相符，表明成功构建了杆状病毒质粒。
　　(2)重组杆状病毒质粒转染sf9昆虫细胞，48h后，细胞变大，裂解死亡，表明杆状病毒质粒转染成功。P1代病毒感染sf9细胞，诱导重组VP1蛋白表达，用VP1基因特异引物经PCR鉴定可以扩增出目的基因，表明目的基因成功整合到杆状病毒质粒中。
　　(3)SDS-PAGE及Western blot检测，在36 kDa出现特异性条带，与目的蛋白大小一致，表明目的蛋白成功表达。纯化的VP1蛋白纯度为90％，浓度为70μg/ml。
　　(4)用纯化的VP1蛋白作为包被抗原，建立ELISPOT检测方法，优化后的实验方案为:蛋白包被浓度为20μg/ml，细胞浓度为5×106/ml，HRP标记抗体稀释度为1∶10000。
　　(5) ELISPOT结果提示，EV71感染者外周血抗VP1抗体分泌细胞明显增加。ELISPOT敏感性为90.0％，特异性96.7％。与ELISA检测抗EV71抗体方法比较，ELISPOT优于ELISA。
　　结论:用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达了EV71 VP1蛋白，以VP1蛋白作为包被抗原建立ELISPOT方法检测EV71感染患者外周血特异性抗体分泌细胞，有较高的特异性和灵敏度，有望成为诊断EV71感染的一种理想方法。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 肠道病毒71型

1．1．1 肠道病毒71型的结构

1．1．2 EV71的VP1蛋白

1．1．3 EV71的流行

1．1．4 EV71感染的临床症状

1．1．5 EV71诊断与治疗

1．1．6 肠道病毒EV71疫苗的研究进展

1．2 昆虫杆状病毒表达系统

1．2．1 杆状病毒的生物学特性

1．2．2 昆虫杆状病毒表达系统原理

1．2．3 Bac-to-Bac表达系统

1．2．4 昆虫杆状病毒表达系统的应用

1．3 酶联免疫斑点技术

1．3．1 ELISPOT技术简介

1．3．2 ELISPOT技术原理

1．3．3 ELISPOT技术的特点

1．3．4 ELISPOT的应用

1．4 手足口病

1．4．1 手足口病简介

1．4．2 HFMD病原学

1．4．3 HFMD流行概况

1．4．4 HFMD临床症状

1．4．5 HFMD的诊断和治疗

1．5 本研究的目的、方法、意义及实验设计方案

1．5．1 研究目的

1．5．2 研究方法

1．5．3 研究意义

1．5．4 实验方案的设计

第二章 应用昆虫-杆状病毒表达系统表达EV71 VP1蛋白的研究

2．1 实验材料

2．1．1 质粒

2．1．2 细胞株、细菌菌株和主要试剂

2．1．3 实验仪器

2．1．4 主要溶液的配置

2．2 实验方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 EV71传代

2．2．3 引物设计及合成

2．2．4 感受态DH5α菌的制备

2．2．5 EV71 VP1基因的获得

2．2．6 重组供体质粒pFastBae1-VP1-his载体的构建

2．2．7 重组穿梭质粒Baemid-VP1-his的构建

2．2．8 重组pFastbae1-VP1-his转染sf9细胞

2．2．9 重组杆状病毒的收获

2．2．10 第一代重组杆状病毒(P1)滴度测定

2．2．11 重组杆状病毒的扩增

2．2．12 重组杆状病毒的PCR鉴定

2．2．13 SDS-PAGE检测

2．2．14 EV71 VP1蛋白的纯化

2．2．15 Western blot检测

2．3 实验结果

2．3．1 VP1基因的获得

2．3．2 重组pFastBac1-VP1质粒酶切鉴定

2．3．3 重组质粒bacmid-VP1的鉴定

2．3．4 Bacmid-VP1-his转染sf9细胞的形态变化

2．3．5 P1代病毒感染sf9细胞的形态变化

2．3．6 病毒样品PCR鉴定

2．3．7 重组蛋白SDS-PAGE分析

2．3．8 Western blot法检测

2．3．9 蛋白浓度及纯度测定

2．4 讨论

第三章 VP1蛋白作为包被抗原检测抗EV71 VP1特异性抗体分泌细胞的研究

3．1 实验材料

3．1．1 主要试剂

3．1．2 主要溶液

3．1．3 主要仪器

3．1．4 检测标本来源

3．2 实验方法

3．2．1 实验对象

3．2．2 外周血单个核细胞的分离及计数

3．2．3 细胞培养

3．2．4 ELISPOT 96孔板包被

3．2．5 接种细胞，培养(注意无菌操作)

3．2．6 培养后操作(不需要无菌操作)

3．2．6 计数

3．2．7 结果分析

3．2．8 抗EV71抗体检测

3．2．9 统计学分析

3．3 实验结果

3．3．1 包被抗原浓度与细胞浓度的确定

3．3．2 HRP标记的抗体浓度的确定

3．3．3 ELISPOT检测抗VP1特异性抗体分泌细胞检测结果

3．3．4 不同组别ELISPOT检测与最终诊断结果的比较

3．3．5 不同组别ELISA检测与最终诊断结果的比较

3．3．6 两种检测方法敏感性及特异性比较

3．3．7 两种检测方法的阳性预测值与阴性预测值比较

3．4 讨论

第四章 主要结论和展望

4．1 主要结论

4．2 主要展望

参考文献

英文缩写索引

致谢

攻读硕士期间发表的论文