HBX蛋白与炎症微环境M2巨噬细胞共同介导EMT促进肝癌细胞侵袭转移

摘要

研究目的：
　　探讨HBX蛋白和炎症微环境M2巨噬细胞对肝癌细胞侵袭转移能力影响。
　　研究方法：
　　1.构建含HBX基因的慢病毒载体感染Hep3B细胞与THP-1来源M2巨噬细胞共培养体系。
　　2.实验分组：感染组（Hep3B+、Hep3B++M2巨噬细胞共培养）、非感染组（Hep3B-、Hep3B-+对照载体LV5、Hep3B-+对照载体LV5+M2巨噬细胞共培养、Hep3B-+M2巨噬细胞共培养）。
　　3.采用蛋白质印迹检测共培养前后Hep3B细胞上皮标志物和间叶标志物表达变化。
　　4.激光共聚焦双免疫荧光进一步分析共培养前后Hep3B细胞EMT标记分子定位及表达变化。
　　5.通过transwell实验检测感染组与非感染组Hep3B细胞侵袭能力。
　　研究结果：
　　1.HBX病毒成功感染靶细胞：重组慢病毒感染Hep3B细胞后，荧光显微镜下观察到HBX慢病毒和对照病毒组的Hep3B细胞上表达GFP，证明慢病毒成功的感染到了细胞中。在第3天时，GFP阳性率最高，所以后续实验中选择感染3天的细胞作为实验对象。WB检测到病毒感染后，HBX表达明显增强
　　2.感染HBX蛋白Hep3B细胞和M2巨噬细胞共培养介导肿瘤细胞发生上皮间质转化（EMT）的Western Blot结果：HBX/LV5成功转染到Hep3B细胞内，并证实在细胞内稳定表达HBX蛋白（Hep3B+）。Hep3B+与M2共培养72h后，经Western Blot检测发现Hep3B+E-cadherin表达（0.42±0.11）较Hep3B-（1.00±0.18）明显下调（t=4.762，P<0.05）， N-cadherin表达（2.85±0.44）较Hep3B-（1.00±0.17）明显上调（ t=6.793，P<0.05）。Hep3B++M2 E-cadherin（0.1±0.13）表达较Hep3B+显著下调（t=3.255，P<0.05）， N-cadherin表达（4.18±0.52）较Hep3B+显著上调（t=10.009，P<0.05）；非感染组E-cadherin【（Hep3B-为1±0.18，Hep3B-+ LV5为1.12±0.23，Hep3B-+ LV5+M2为0.66±0.19，Hep3B-+M2为0.78±0.19）,F=3.302, P>0.05】和N-cadherin【（Hep3B-为1.00±0.17，Hep3B-+ LV5为,0.81±0.19，Hep3B-+M2+ LV5为1.25±0.15，Hep3B-+M2为1.20±0.22），F=5.304, P>0.05】表达水平无明显变化，差异均无统计学意义；
　　3.激光共聚焦双免疫荧光分析EMT标记分子表达水平变化及其亚细胞定位情况：E-cadherin和N-cadherin均表达于细胞连接处，E-cadherin在非感染组（Hep3B-、Hep3B-+M2巨噬细胞共培养组）红色免疫荧光清晰可见(E-cadherin↑)，在感染组（Hep3B+、）红色免疫荧光明显变（E-cadherin↓）,Hep3B++M2巨噬细胞共培养组红色免疫荧光接近消失；N-cadherin在非感染组（Hep3B-、Hep3B-+M2巨噬细胞共培养组）红色免疫荧光微弱，在感染组（Hep3B+、）红色免疫荧光显示明显(N-cadherin↑)，Hep3B++M2巨噬细胞共培养组红色免疫荧光进一步增强(N-cadherin↑↑)。
　　4. HBX蛋白和 M2巨噬细胞对 Hep3B细胞侵袭能力影响：感染组 Hep3B+组(261±15.62）较非感染对照组Hep3B-(70.33±19.75)的侵袭细胞数明显增加，两组间差异有统计学意义（t=13.115,P<0.05）；感染组中Hep3B++M2（335.33±24.218）较Hep3B+侵袭能力显著增强，差异有统计学意义（t=4.467,P<0.05），而非感染组（Hep3B-组70.33±19.75, Hep3B-+M2组109.33±31.62）侵袭能力无明显变化，差异无统计学意义（t=1.812,P>0.05）。
　　研究结论：
　　1.乙肝病毒HBX蛋白能诱导Hep3B细胞发生EMT，同时Hep3B细胞获得侵袭转移能力；
　　2. HBX蛋白与M2巨噬细胞产生协同效应共同介导EMT，Hep3B细胞侵袭转移能力显著增强；
　　3.乙肝病毒HBX蛋白和M2巨噬细胞共同介导肝癌侵袭转移，其机制可能是EMT和Crosstalk（M2巨噬细胞与肿瘤细胞之间的交叉对话）。