大鼠鼻黏膜外胚间充质干细胞的干细胞特性研究及其在治疗脊髓损伤中的应用

摘要

目的:
　　外胚间充质干细胞(Ecto-mesenchymal stem cells，EMSCs)是间充质干细胞的特殊类型，起源于胚胎时期的神经嵴(Neural crest)，具有自我更新和多向分化潜能。本研究旨在探讨大鼠鼻黏膜来源的EMSCs的干细胞特性和多向分化潜能，并探讨其在纤维蛋白(Fibrin)支架上的多向分化潜能，为组织工程干细胞/支架移植寻找新的种子细胞。最后，将EMSCs/Fibrin支架移植到大鼠脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）模型，评价其对脊髓损伤的修复效果。
　　方法:
　　1.制作大鼠鼻黏膜冰冻切片，用EMSCs标志蛋白Nestin，CD133，CD44进行免疫荧光染色，观察其在大鼠鼻黏膜的分布特征。
　　2.用差速贴壁法纯化EMSCs，并用成球实验及各种干细胞标志蛋白评价其干细胞特性。
　　3.用成骨诱导培养基诱导EMSCs向成骨细胞分化。用碱性磷酸酶染色检测碱性磷酸酶活性;茜素红染色检测诱导后细胞表面钙结节来评价成骨诱导效果;用免疫荧光和蛋白免疫印迹检测Collagen-Ⅰ、Osteocalcin、Osteopuntin及Runx2的表达水平评价EMSCs向成骨细胞诱导分化的效果。
　　4.用神经诱导培养基诱导EMSCs向神经细胞分化。用神经标志蛋白Synapsin，Synaptotagmin，GAP43及NF-200进行免疫荧光和蛋白免疫印迹，评价EMSCs向神经细胞的分化效果。
　　5.用雪旺细胞诱导培养基诱导EMSCs向雪旺细胞分化。用雪旺细胞标志蛋白GFAP，p75，S100β，CNPase进行免疫荧光和蛋白免疫印迹，评价EMSCs向雪旺细胞的分化效果。
　　6.EMSCs与大鼠脊髓来源神经干细胞进行Transwell非接触共培养，免疫荧光检测评价该体系下EMSCs对神经干细胞向神经细胞分化的影响。
　　7.EMSCs与大鼠脊髓来源神经干细胞接触共培养，活细胞动态摄影及免疫荧光检测评价该体系下EMSCs对神经干细胞向神经细胞分化的影响。
　　8.接触共培养体系中加入RGD，Integrinβ1抗体及BOC抗体，观察并简要探讨RGD，Integrinβ1抗体及BOC抗体对神经干细胞分化的抑制作用。
　　9.用扫描电子显微镜检测(Scanning electron microscopy，SEM)及透射电子显微镜检测(Transmission electron microscopy，TEM)观察Fibrin支架的结构特征。EMSCs种植于Fibrin支架后，用苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin，HE)染色评价EMSCs与Fibrin支架的生物相容性。
　　10.用免疫荧光和蛋白免疫印迹检测EMSCs在Fibrin支架上的自发分化情况。
　　11.用免疫荧光、蛋白免疫印迹、SEM和TEM等方法检测EMSCs在Fibrin支架上向成骨细胞、神经细胞和雪旺细胞的诱导分化效果（方法同上述3-5）。
　　12.将EMSCs/Fibrin支架移植入大鼠脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)模型，观察EMSCs在脊髓的迁移情况，BBB评分（Basso，Beattie，Bresnahan scoring）评价大鼠后肢运动功能恢复情况。用免疫荧光、免疫组化、TEM及蛋白免疫印迹等方法观察评价损伤脊髓神经元的再生情况。
　　结果:
　　1.鼻黏膜组织冰冻切片免疫荧光染色显示，CD133，Nestin及CD44阳性细胞广泛分布于鼻中隔两侧黏膜固有层内。
　　2.EMSCs在抗贴壁培养时，可形成CD133，Nestin及Sox1阳性的干细胞球。差速贴壁纯化后的第三代EMSCs显示出很强的干性，表达神经外胚层干细胞相关蛋白和间充质干细胞标志蛋白Nestin，Sox1，Sox10，S100，Snail，Ⅵmentin，CD44，CD133，Sa114及含RGD序列细胞外基质的受体integrinβ1等。
　　3.EMSCs经成骨诱导培养基诱导2周后，碱性磷酸酶活性明显增强，成骨细胞标志蛋白Collagen-Ⅰ、Osteocalcin、Osteopuntin及Runx2的表达量明显升高。诱导3周后，茜素红染色可观察到大量的钙结节。
　　4.EMSCs用神经诱导培养基诱导培养14天后，神经标志蛋白Synapsin，Synaptotagmin，GAP43及NF-200的表达量明显升高。
　　5.EMSCs用雪旺细胞诱导培养基诱导培养14天后，雪旺细胞标志蛋白GFAP，p75，S100β，CNPase的表达量明显升高。
　　6.EMSCs与脊髓来源的神经干细胞的Transwell非接触共培养结果显示，共培养组神经突触的数量和长度明显增加，并可形成神经网络。
　　7.EMSCs与脊髓来源的神经干细胞接触共培养结果显示，单神经细胞组细胞表达神经细胞标志蛋白GAP43及神经胶质细胞标志蛋白GFAP，而共培养组只表达GAP43，不表达GFAP。
　　8.接触共培养体系中加入RGD，Integrinβ1抗体及BOC抗体后，神经纤维的生长受到抑制。
　　9.SEM和TEM检测不同浓度Fibrin支架的结构发现低浓度(12.5-50mg/ml)的Fibrin支架呈疏松多孔的海绵状结构，并且随着浓度升高，孔径减小，密度增加。而当纤维蛋白浓度达到75 mg/ml，纤维蛋白胶则聚集成块状结构。HE染色结果显示，EMSCs在低浓度Fibrin支架上生长良好。
　　10.免疫荧光和蛋白免疫印迹结果显示，EMSCs在Fibrin支架上培养12天后，可表达雪旺细胞标志蛋白CNPase，MBP，GalCer及雪旺细胞可分泌的神经营养因子BDNF，NGF，NT-3等。
　　11.免疫荧光、蛋白免疫印迹、SEM和TEM等结果显示，EMSCs在Fibrin支架上也可诱导分化为成骨细胞、神经细胞及雪旺细胞，并且分化效果优于在L-多聚赖氨酸(poly-L-Lysine，PLL)对照组，而且EMSCs能够改建Fibrin支架，使其更利于细胞的生长。
　　12.将EMSCs/Fibrin支架移植入大鼠脊髓损伤模型，可观察到EMSCs从移植处向脊髓两端迁移。术后12周BBB评分结果发现大鼠后肢运动功能恢复情况良好，而对照组无明显恢复。免疫荧光、免疫组化、TEM及蛋白免疫印迹等结果显示，EMSCs/Fibrin移植组神经再生相关蛋白GAP43，NF-200及MBP的表达量明显高于SCI组及Fibrin组，神经再生能力明显提高，神经细胞被很厚的髓鞘包被。
　　结论:
　　1.EMSCs广泛分布于嗅部和呼吸部黏膜固有层内，并具有很强的干性，具有向成骨细胞、神经细胞及雪旺细胞分化的潜能。
　　2.EMSCs与Fibrin支架生物相容性良好，并能在Fibrin支架上自发分化为雪旺细胞。
　　3.EMSCs在Fibrin支架上能更有效的分化为成骨细胞、神经细胞和雪旺细胞，并可以改建Fibrin支架，使之更利于EMSCs的生长分化。
　　4.EMSCs/Fibrin支架移植到大鼠横断脊髓损伤模型，能有效恢复大鼠后肢运动功能。EMSCs是组织工程中一种很有利用前景的种子细胞，可用于自体移植修复脊髓损伤。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第一章 绪论

1．1 间充质干细胞

1．1．1 间充质干细胞的生物学特性

1．1．2 间充质干细胞的研究进展

1．2 神经嵴干细胞(Neural crest stem cells，NCSCs)与外胚间充质干细胞(Ectomesenchymal stem cells，EMSCs)

1．2．1 NCSCs与EMSCs的生物学特性

1．2．2 NCSCs与EMSCs的研究进展

1．3 组织工程

1．3．1 种子细胞

1．3．2 支架材料

1．4 研究目的内容及技术路线

1．4．1 研究目的

1．4．2 研究内容

1．4．3 技术路线

第二章 EMSCs在大鼠鼻黏膜的分布及其干细胞特征

2．1 大鼠鼻黏膜的组织切片及免疫荧光染色

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．1．3 结果

2．1．4 讨论

2．2 呼吸部鼻黏膜的取材及EMSCs的体外扩增培养

2．2．1 材料

2．1．2 方法

2．1．3 结果

2．2．3 讨论

2．3 EMSCs干细胞标志蛋白的免疫荧光染色

2．3．1 材料

2．3．2 方法

2．3．3 结果

第三章 EMSCs的多向分化

3．1 EMSCs向成骨细胞诱导分化

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．1．3 结果

3．1．4 讨论

3．2 EMSCs向神经细胞诱导分化

3．2．1 材料

3．2．2 方法

3．2．3 结果

3．2．4 讨论

3．3 EMSCs向雪旺细胞诱导分化

3．3．1 材料

3．3．2 方法

3．3．3 结果

3．3．4 讨论

第四章 EMSCs对脊髓来源的神经干细胞分化的影响

4．1 脊髓神经干细胞的培养和鉴定

4．1．1 材料

4．1．2 方法

4．1．3 结果

4．2 EMSCs与神经干细胞的非接触共培养

4．2．1 材料

4．2．2 方法

4．2．3 结果

4．2．4 讨论

4．3 EMSCs与神经干细胞的接触共培养

4．3．1 材料

4．3．2 方法

4．3．3 结果

4．3．4 讨论

第五章 EMSCs在纤维蛋白支架上的定向分化

5．1 纤维蛋白支架的制备及其表征

5．1．1 材料

5．1．2 方法

5．1．3 结果

5．1．4 讨论

5．2 EMSCs在纤维蛋白支架上自发分化

5．2．1 材料

5．2．2 方法

5．2．3 结果

5．2．4 讨论

5．3 EMSCs在纤维蛋白胶上向成骨细胞的定向诱导分化

5．3．1 材料

5．3．2 方法

5．3．3 结果

5．3．4 讨论

5．4 EMSCs在纤维蛋白胶上向神经细胞的定向诱导分化

5．4．1 材料

5．4．2 方法

5．4．3 结果

5．4．3 讨论

5．5 EMSCs在纤维蛋白支架上向雪旺细胞的定向分化

5．5．1 材料

5．5．2 方法

5．5．3 结果

5．5．4 讨论

第六章 EMSCs／Fibrin支架移植修复脊髓损伤的疗效评价

6．1 脊髓损伤动物模型的建立及EMSCs／Fibrin支架移植

6．1．1 材料

6．1．2 方法

6．1．3 结果

6．1．3 讨论

6．2 EMSCs／Fibrin支架移植修复脊髓损伤效果的评价

6．2．1 材料

6．2．2 方法

6．3 结果

6．3．1 大鼠后肢运动功能评分

6．3．2 脊髓组织切片的免疫荧光染色和免疫组织化学染色

6．3．3 脊髓横断处超微结构的观察

6．3．4 脊髓组织中神经再生相关蛋白含量的蛋白免疫印迹检测

6．4 讨论

第七章 主要结论及展望

7．1 本研究的主要结论

7．2 展望

参考文献

致谢

在学期间发表的学术论文