象草内生菌的筛选鉴定及其促生机制研究

摘要

化石能源的逐渐枯竭及使用过程中所带来的一系列环境问题无疑成为目前关注的热点，生物质能源作为一种新型的可再生能源，在能源与环境的可持续发展方面发挥着重要作用。以草本纤维素类为主的能源植物作为生物质能源开发和利用的重要对象，是目前最具前景的生物质原料之一，具有广阔的开发和利用前景。杂交狼尾草（美洲狼尾草与象草杂交）作为一种草本植物，凭借着其光合作用效率高（C4植物）、生物量大、抗逆性强、纤维素、半纤维素含量较高等优良性状，极具能源利用和转化的潜力。面对我国能源植物产业化种植通常需要种植在土壤条件较差的边际性土地等不良生态环境下的挑战，植物内生菌资源的发掘与利用，在增强植物的抗逆性、促进植物生长、提高植物对土壤中营养物质的利用率等方面有着及其重大的科学与应用的现实意义。本研究通过从象草(Pennisetum purpureum)根部筛选内生菌，在对其促生现象进行充分评估的基础上，进一步对多株内生菌的定殖能力及促生机制进行了系统的观察与研究。该研究首次探讨了在边际性土地的种植条件下，如何提高杂交狼尾草生物质产量，开拓了内生菌生物肥料应用的新思路、新途径。
　　本研究的主要结果归纳如下:
　　1.研究成功地从象草根部分离出13株植物内生菌，通过16S rDNA，PCR扩增测序，NCBI同源性比较对其进行分子生物学鉴定，这些内生菌分别属于鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、菠萝泛菌属(Pantoea sp.)和肠杆菌属(Enterobacter sp.)。进一步以鞘氨醇单胞菌属pp01、芽孢杆菌属pp02、泛菌属pp04及肠杆菌属pp06为研究对象，通过对四株不同内生菌生理生长特性进行了系统研究，提出了最佳发酵生长条件，为内生菌的机制研究和产业化应用开发奠定了重要基础。
　　2.内生菌灌根处理杂交狼尾草的盆栽试验结果表明，无论是各菌株单独作用还是多种内生菌的混合作用，与未接菌的对照组相比，灌根菌液浓度达OD600=1.0时，在显著性水平p＜0.05的条件下，对100 mM盐(NaCl)胁迫下的杂交狼尾草的生长均具有显著的促生作用。鞘氨醇单胞菌属pp01、芽孢杆菌属pp02、泛菌属pp04、肠杆菌属pp06、混合菌五种不同处理，其株高比对照组可分别增加34.61，30.85，35.90，16.49和64.85％;地上部分鲜重分别增加91.62，74.65，104.66，46.77和124.69％;干重分别增加107.00，47.07，111.13,37.52和119.08％。
　　3.内生菌在植物根部的种群定殖能力是内生菌促生的重要因素之一。本文通过定量分析及显微观察，确定了四株不同内生菌在植物根部的定殖能力及定殖部位。通过植物根样定殖微生物菌落的计数比较(cfu/g)，可以看出四株不同内生菌的侵染能力有所差异:泛菌属pp04＞鞘氨醇单胞菌pp01＞肠杆菌pp06＞芽孢杆菌pp02。通过对植物根部的显微观察发现，四株内生菌均能够成功地侵染到植物根部，并通过皮层进入维管束系统，实现内生菌在植物根部的成功定殖。
　　4.植物内生菌促生机制的进一步研究表明，四株菌株均具有分泌生长素(IAA)的能力，固氮能力，1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶酶活及溶磷能力。同时除了泛菌属pp04不具有产铁载体的能力外，其它三种菌株均具有产铁载体的能力。由此可见，植物内生菌的固氮能力对植物的生长具有十分重要的促进作用。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 能源与环境可持续发展

1．2 能源植物研究现状

1．3 狼尾草作为新型能源植物在边际性土地上的开发前景及面临的问题

1．4 植物内生菌的研究进展及对能源植物开发的意义

1．4．1 植物内生菌的概念

1．4．2 内生菌的普遍性及多样性

1．4．3 内生菌的生物学功能

1．4．4 内生菌的作用机制

1．4．5 内生菌的应用前景

1．5 本文研究的目的及意义

1．6 本文主要研究内容及技术路线

1．6．1 主要研究内容

1．6．2 技术路线

第二章 内生菌的分离与鉴定

2．1 材料

2．1．1 植物材料及菌株

2．1．2 化学试剂及培养基

2．1．3 分子生物学试剂及试剂盒

2．1．4 仪器

2．2 方法

2．2．1 象草根部内生菌的筛选

2．2．2 内生菌的鉴定

2．2．3 内生菌的形态鉴定

2．2．4 内生菌生长最适pH值的测定

2．2．5 内生菌最适生长温度的测定

2．2．6 内生菌耐盐性的测定

2．2．7 内生菌生长曲线的测定

2．3 结果与分析

2．3．1 内生菌的筛选

2．3．2 内生菌的分子鉴定

2．3．3 内生菌形态鉴定

2．3．4 内生菌生长最适pH值

2．3．5 内生菌生长最适温度

2．3．6 内生菌的耐盐性

2．3．7 内生菌生长曲线

2．4 本章小结

第三章 内生菌促生效果研究

3．1 材料

3．1．1 植物材料及菌株

3．1．2 化学试剂及培养基

3．1．3 仪器

3．2 方法

3．2．1 菌悬液的制备

3．2．2 杂交狼尾草种子的萌发及播种

3．2．3 不同NaCl浓度胁迫下，内生菌对杂交狼尾草的促生及耐盐效果

3．2．4 不同浓度菌液接种对内生菌促生及耐盐效果的影响

3．2．5 四株内生菌单独及混合接种对杂交狼尾草促生效果的影响

3．2．6 数据统计分析

3．3 结果与分析

3．3．1 不同NaCl浓度胁迫下，内生菌对杂交狼尾草生长的影响

3．3．2 菌液最佳接种浓度的确定

3．4 本章小结

第四章 内生菌在杂交狼尾草根系中的定殖过程研究

4．1 材料

4．1．1 植物材料及菌株

4．1．2 化学试剂及培养基

4．1．3 仪器

4．2 方法

4．2．1 内生菌在植物体内的定殖能力研究

4．2．2 内生菌在植物根部定殖部位的显微观察

4．3 结果与分析

4．3．1 内生菌在植物根部的定殖能力

4．3．2 内生菌在杂交狼尾草根部的定殖部位

4．4 本章小结

第五章 内生菌促生机制的研究

5．1 材料

5．1．1 菌株

5．1．2 化学试剂及培养基

5．1．3 仪器

5．2 方法

5．2．1 内生菌分泌IAA特性的测定

5．2．2 内生菌固氮能力的测定

5．2．3 内生菌ACC脱氨酶活性的测定

5．2．4 内生菌铁载体合成能力测定

5．2．5 内生菌溶磷能力的测定

5．3 结果与分析

5．3．1 内生菌产植物生长素(IAA)能力

5．3．2 内生菌固氮能力的测定

5．3．3 内生菌的ACC脱氨酶活性

5．3．4 内生菌铁载体合成能力

5．3．5 内生菌的溶磷能力测定

5．4 本章小结

第六章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

致谢

附录