基于量子点和生物传感元件检测真菌毒素的研究

摘要

莲子为睡莲科水生草本植物莲Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥成熟种子，是我国常用的大宗中药材，由于其极高的药用和滋补价值，在食用和医疗保健中发挥了十分重要的作用，也是我国中药材出口创汇的重要品种之一。该品多产于我国湖北、湖南、福建等南方温湿地区，富含油脂和淀粉，储藏不当，则易发生霉变。前期研究，发现莲子在采收、储藏和流通过程中易受真菌毒素污染，严重影响了莲子药材的质量、安全性和出口创汇。针对莲子真菌毒素污染研究，尤其以黄曲霉毒素和赭曲霉毒素研究最多，其中黄曲霉毒素，阳性率达70％，其中30％的样品中AFB1含量超出了限量标准(5μg/kg)，25％的样品AFs总量超出了限量标准(10μg/kg)，国外亦有莲子中黄曲霉毒素污染的报道，为莲子的“药用”和“食用”带来严重的安全隐患。鉴于莲子药材中黄曲霉素和赭曲霉毒素的污染情况，很有必要建立灵敏准确的快速筛查分析方法，随行监控采收、储藏和流通过程中药材真菌毒素的污染状况，保障药材质量。基于此本论文主要研究内容和结论如下:
　　(1) CdSe/CdS核壳量子点的合成。研究采用液体石蜡作为反应溶剂，Cd(DDTC)2为前驱体，以连续壳层前驱体注入方式合成CdSe/CdS核壳型量子点，并采用透射电镜对其形貌特征进行表征。实验优化了油胺和壳层前驱体在整个反应体系中的用量，结果表明，在50％（体积比）油胺和10次前驱体加入量的条件下，成功制备了点状CdSe/CdS核壳量子点。
　　(2)基于适配子标记量子点检测OTA。本章首先将油溶性CdSe/CdS量子点转化为可用于生物标记的水溶性量子点。其次，通过硫代碱基修饰的ssDNA作为量子点配体，其功能区含有我们需要标记的适配子，“锚”区作为连接量子点的标记区。通过改变“锚”区硫代碱基的数目，达到控制标记在量子点表面ssDNA数目。最后，我们用优化的ssDNA-CdSe/CdS作为生物传感器，建立OTA的检测方法，结果显示，OTA在1-30 ng/mL范围内线性关系良好(R2＞0.9513)，其线性拟合方程为y=4.75x+323.18，满足限量标准5 ng/mL的检测要求。
　　(3)建立间接竞争酶联免疫吸附法快速筛检莲子中黄曲霉毒素B1的污染水平。本法采用间接竞争酶联免疫法测定了经甲醇-水(80∶20)溶液提取后莲子药材中的黄曲霉毒素B1。通过对包被抗原和一抗工作浓度进行优化，建立了最佳ic-ELISA法，结果显示，AFB1在0.171～7.25 ng/mL之间线性关系良好，R2＞0.978，IC50为1.29 ng/mL，回收率在74.73％～126.9％之间，该法检测限为0.128 ng/mL。应用该法检测20批莲子药材，结果显示:1～15号样品（30℃、30％湿度条件下贮藏一年）中AFB1污染水平为1.19～115.3μg/kg，40％样品中AFB1含量超过限量标准，16～20号样品（新购买）中AFB1污染率为40％。对上述结果采用液质联用确证，样品中AFB1与标品具有相同的保留时间、离子碎片、离子碎片丰度比，排除了假阳性的检测结果。表明本研究建立的ic-ELISA分析方法操作简便、灵敏、结果准确，可用于莲子中AFB1的高通量现场快速检测。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 真菌毒素研究概况

1．1．1 黄曲霉素B1的性质、危害及检测研究进展

1．1．2 赭曲霉毒素A的性质、危害及检测研究进展

1．2 量子点研究概况

1．2．1 量子点的性能特征

1．2．2 量子点的合成

1．2．3 量子点的应用进展

1．3 适配子的研究概况

1．3．1 适配子的性能特征

1．3．2 适配子的应用进展

1．3．3 赭曲霉毒素A的适配子研究进展

1．4 酶联免疫分析研究进展

1．4 本课题的立题背景和意义

1．5 本论文研究的主要内容

第二章 CdSe／CdS核壳量子点的合成

2．1 实验试剂、材料

2．2 仪器与设备

2．3 实验方法

2．3．1 合成二乙基二硫代氨基甲酸镉(Cd(DDTC)2)

2．3．2 合成硬脂酸镉(CdSt2)

2．3．3 前驱体的配制

2．3．4 合成硒化镉(CdSe)量子点

2．3．5 合成CdSe／CdS核壳量子点

2．3．6 量子点的表征

2．4 结果与讨论

2．4．1 反应体系的选择

2．4．2 核心CdSe的合成

2．4．3 壳层CdS的包覆

2．5 本章小结

第三章 基于适配子标记量子点的生物传感器检测OTA

3．1 实验部分

3．1．1 实验试剂、材料

3．1．2 仪器与设备

3．1．3 实验方法

3．1．4 结果与讨论

3．2 本章小结

第四章 间接竞争酶联免疫吸附法快速筛检莲子中黄曲霉毒素B1的污染水平

4．1 实验部分

4．1．1 实验试剂、材料

4．1．2 仪器与设备

4．1．3 实验方法

4．2 结果与讨论

4．2．1 最适浓度的优化

4．2．2 基质效应和标准曲线制备

4．2．3 交叉反应率的测定

4．2．4 精密度、稳定性、重复性考察

4．2．5 回收率考察

4．2．6 样品中AFB1的ic-ELISA检测

4．2．7 UFLC-MS／MS确证

4．3 本章小节

第五章 全文总结与展望

5．1 主要结论

5．2 展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文