树突状细胞诱导胸腺上皮细胞系(MTEC-1)凋亡机制的体外研究

摘要

目的：体外研究证实树突状细胞可通过Notch受体与Jagged1配体转导的信号诱导胸腺上皮细胞系(mouse thymic epithelial cell line1，MTEC-1)凋亡，为治疗严重感染、移植排斥反应和肿瘤的放化疗等原因所引起的胸腺萎缩导致细胞免疫功能缺陷奠定基础。
　　方法：分离骨髓细胞，体外采用GM-CSF和IL-4诱导分化为骨髓来源的树突状细胞(bone marrow derived dendritic cell，BMDC)，然后经LPS刺激促进其成熟，最后采用real-time PCR和流式细胞术分析BMDC的Jagged1表达水平;将成熟的BMDC与MTEC-1共培养，采用流式细胞术分析MTEC-1凋亡的变化，为进一步验证Notch/Jagged1诱导胸腺上皮细胞凋亡，我们采用转染Jagged1基因的成纤维细胞和重组Jagged1蛋白分别与MTEC-1共培养，再用流式细胞术检测MTEC-1凋亡水平;最终应用γ分泌酶抑制剂DAPT阻断信号途径来验证Notch/Jagged1途径是否参与DC诱导胸腺上皮细胞的凋亡。
　　结果：研究发现成熟的BMDC表面Notch配体Jagged1表达水平较不成熟的BMDC高;成熟的BMDC在体外与MTEC-1共培养后能明显诱导MTEC-1的凋亡，进一步利用Jagged1转基因的成纤维细胞或重组Jagged1蛋白与MTEC-1共培养，同样证实了Notch/Jagged1信号能介导MTEC-1的凋亡;在相同的共培养体系中加入DAPT阻止Notch/Jagged1信号通路可以下调MTEC-1凋亡比例。
　　结论：本研究结果表明成熟的DC可以通过Notch/Jagged1信号途径诱导胸腺上皮细胞系的凋亡。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 Notch信号通路

1．1．1 Notch受体

1．1．2 Notch配体

1．1．3 Notch信号的活化

1．2 树突状细胞

1．2．1 树突状细胞的分类

1．2．2 树突状细胞的功能

1．3 胸腺

1．3．1 胸腺上皮细胞

1．3．2 胸腺退化和萎缩的机制

第二章 研究目的、方法、实验设计方案和意义

2．1 研究目的

2．2 研究内容

2．3 研究方法

2．4 实验设计方案

2．5 研究意义

第三章 活化的DC诱导胸腺上皮细胞MTEC-1凋亡机制的研究

3．1 材料与仪器

3．1．1 试剂

3．1．2 主要仪器和耗材

3．1．3 主要溶液的配置

3．2 实验方法

3．2．1 细胞培养

3．2．2 Total RNA的提取及逆转录cDNA

3．2．3 Real-time PCR

3．2．4 AnnexinV-FITC/PI双染色标记流式细胞仪检测细胞凋亡

3．2．5 AnnexinV-APC/7-AAD双染色标记流式细胞仪检测细胞凋亡

3．2．6 DH5α感受态菌的制备

3．2．7 质粒的提取及鉴定

3．2．8 统计分析

3．3 实验结果

3．3．1 成熟BMDC上调Jagged1表达

3．3．2 BMDC通过Jagged1诱导MTEC-1细胞凋亡

3．3．3 Notch/Jagged1信号转导抑制剂γ-分泌酶抑制剂(DAPT)抑制Jagged1介导的MTEC-1细胞凋亡

3．3．4 BMDC回迁胸腺

3．4 讨论

第四章 主要结论及展望

4．1 主要结论

4．2 展望

参考文献

文献综述

致谢

攻读硕士学位期间发表的文章及参加的会议