PKGⅡ对LPA诱导的胃癌细胞迁移及RhoA和Rac1激活的影响

摘要

目的: 检测Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶(TypeⅡ cGMP-dependent protein kinase，PKGⅡ)在癌细胞株和胃癌组织中的表达，明确PKGⅡ对溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)引起的胃癌细胞迁移的影响，阐明PKGⅡ对LPA诱导的迁移相关小G蛋白RhoA及Rac1活化的作用机制。 方法: (1)采用RT-PCR的方法，检测PKGⅡ在胃癌细胞株、乳癌细胞株、肾癌细胞株及对应上皮细胞株中的表达;采用荧光定量PCR的方法，检测PKGⅡ在胃癌组织中的表达;用Wilcoxon Signed Ranks Test分析PKGⅡ在胃癌组织及对应癌旁组织中的差异;用Mann-Whitney U test或Kruskal-Wallish test分析PKGⅡ表达和胃癌患者临床参数的相关性。 (2)通过感染编码PKGⅡ cDNA的腺病毒Ad-PKGⅡ，增加胃癌细胞AGS和HGC-27内PKGⅡ的表达。以8-pCPT-cGMP特异性激活胃癌细胞或胃黏膜上皮细胞内的PKGⅡ，再加入LPA，采用Transwell迁移实验分析细胞的迁移活动;采用荧光染色法检测细胞内应激纤维的变化;采用pull-down法、Western blotting检测小G蛋白RhoA和Rac1的活性变化;采用Western blotting检测MAPK/ERK通路和PI3K/Akt通路中相关信号分子的活性;采用IP和Western blotting方法检测PKGⅡ对EGFR的酪氨酸磷酸化作用。 (3)构建质粒pFlag-RhoA、pFlag-RhoA188A和pFlag-Rac1，分别转染胃癌细胞AGS和HGC-27，再感染腺病毒Ad-LacZ或Ad-PKGⅡ，并以8-pCPT-cGMP特异性激活PKGⅡ，采用IP和Western blotting方法检测PKGⅡ对小G蛋白RhoA及Rac1的丝氨酸和苏氨酸磷酸化的作用。 (4)胃癌细胞AGS感染腺病毒Ad-LacZ或Ad-PKGⅡ，并以8-pCPT-cGMP特异性激活PKGⅡ，采用Co-IP方法检测PKGⅡ与RhoA的相互结合;构建质粒pBiFC-RhoA-VC和pBiFC-PKGⅡ-VN，并共转染COS-7细胞，利用双分子荧光互补实验检测活细胞内PKGⅡ与RhoA的结合情况;构建PKGⅡ与RhoA不同域段的原核表达载体，并转化大肠杆菌、表达相应蛋白，用pull-down法检测PKGⅡ各缺失型突变体与RhoA的结合以及RhoA各缺失型突变体与PKGⅡ的结合。 (5)将MAPK/ERK通路、PI3K/Akt通路和PLC/IP3/DAG通路的抑制剂分别作用胃癌细胞AGS和HGC-27，采用pull-down法、Western blotting检测小G蛋白RhoA和Rac1的活性变化。 (6)将EGFR的抑制剂作用于胃癌细胞AGS和HGC-27，再加入LPA，采用pull-down法、Western blotting检测小G蛋白Rac1和RhoA的活性变化，用Western blotting检测MAPK/ERK通路和PI3K/Akt通路中相关信号分子的活性。 结果: (1)在人胃黏膜上皮细胞、人乳腺上皮细胞和人胚肾上皮细胞中，人胃黏膜上皮细胞株GES-1的PKGⅡ含量最高;在上述三组不同组织来源的上皮细胞及对应癌细胞株中，人胃黏膜上皮细胞株GES-1与胃癌细胞株之间的PKGⅡ表达差异最为明显;在74例胃癌组织标本中，49例癌组织PKGⅡ的表达低于癌旁组织（P＜0.05），占总例数的66.2％(49/74)，但与临床病理参数无显著相关性。 (2)活化的内源性PKGⅡ可以抑制由LPA诱导的人胃黏膜上皮细胞株GES-1细胞的迁移;活化的外源性PKGⅡ可以抑制由LPA诱导的人胃癌细胞株AGS和HGC-27细胞的迁移及细胞骨架的形成。 (3)活化的外源性PKGⅡ可以抑制LPA对小G蛋白RhoA的激活;PKGⅡ可使RhoA发生丝氨酸和苏氨酸磷酸化，188丝氨酸位点是PKGⅡ磷酸化RhoA的特异性位点;PKGⅡ可与RhoA发生结合，且结合部位为PKGⅡ的氨基段和RhoA的氨基段。 (4)活化的外源性PKGⅡ可以抑制LPA对小G蛋白Rac1的活性，但不能使Rac1发生明显的磷酸化;PKGⅡ可以通过降低LPA引起的EGFR酪氨酸磷酸化，及其下游的MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路，进而抑制LPA引起的小G蛋白Rac1的活化。 结论: PKGⅡ在人胃癌细胞中的表达低于胃黏膜上皮细胞，在胃癌组织中的表达低于癌旁组织;内外源性PKGⅡ活化后可分别抑制LPA诱导的人胃黏膜上皮细胞及胃癌细胞的迁移;PKGⅡ可以抑制LPA引起的迁移相关小G蛋白RhoA和Rac1活化;PKGⅡ通过与RhoA结合使其发生188位丝氨酸磷酸化;PKGⅡ通过抑制LPA引起的EGFR酪氨酸磷酸化（活化），及其下游MAPK-ERK和PI3K-Akt通路的信号转导，进而抑制Rac1的活性。

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摘要

英文缩写索引

第一章 绪论

1．1 LPA的研究背景

1．1．1 LPA的代谢

1．1．2 LPA受体

1．1．3 LPA与肿瘤

1．1．4 LPA信号通路与肿瘤细胞的迁移

1．2 PKGⅡ的研究背景

1．2．1 PKG的分类与分布

1．2．2 PKGⅡ的结构

1．2．3 PKGⅡ活性的调节

1．2．4 PKGⅡ的主要功能

1．2．5 PKGⅡ与肿瘤的联系

1．3 研究目的和研究意义

1．3．1 研究目的

1．3．2 研究意义

1．4 研究内容、方法和技术路线

1．4．1 研究内容

1．4．2 方法

1．4．3 技术路线

第二章 PKGⅡ在胃癌细胞及胃癌组织中的表达及临床意义

2．1 材料

2．2 方法

2．3 结果

2．3．1 RT-PCR检测PKGⅡ在上皮细胞及癌细胞株中的表达

2．3．2 实时荧光定量PCR检测胄癌组织及癌旁组织中PKGⅡ的表达

2．4 讨论

第三章 内外源性PKGⅡ对LPA引起的细胞迁移活动的影响

3．1 材料

3．2 方法

3．3 结果

3．3．1 内源性PKGⅡ对胃黏膜上皮细胞迁移活动的影响

3．3．2 外源性PKGⅡ对胃癌细胞活动的影响

3．4 讨论

第四章 PKGⅡ对LPA诱导的RhoA活化的影响机制

4．1 材料

4．2 方法

4．3 结果

4．3．1 PKGⅡ对LPA诱导的RhoA活化的影响

4．3．2 PKGⅡ对RhoA的磷酸化作用

4．3．3 PKGⅡ与RhoA蛋白的结合

4．4 讨论

第五章 PKGⅡ对LPA诱导的Rac1活化的影响机制

5．1 材料

5．2 方法

5．3 结果

5．3．1 PKGⅡ对LPA诱导的Rae1活化的影响

5．3．2 PKGⅡ对Rac1的磷酸化作用

5．3．3 LPA诱导的Rac1及RhoA活化与MAPK-ERK，P13K-Akt及PLCγ1-IP3／DAG通路间的关系

5．3．4 PKGⅡ对LPA诱导的MAPK-ERK及P13K-Akt通路的影响

5．3．5 PKGⅡ对LPAR的影响

5．3．6 PKGⅡ对LPA诱导的EGFR活化的影响

5．4 讨论

第六章 主要结论和展望

6．1 主要结论

6．2 展望

参考文献

致谢

攻读博士期间发表的论文