依赖于环指蛋白8的人DNA聚合酶δ体外泛素化反应探讨

摘要

在真核生物B-家族三种主要DNA聚合酶（Polα、Polδ和Polε）中，Polδ是最重要的一种复制性聚合酶，除了在染色体 DN A复制过程中起重要作用外，它还参与多种形式的DN A损伤修复过程，在维持细胞周期的正常调节以保证基因组结构的完整性和遗传稳定性方面具有特殊的重要意义。人源 DN A聚合酶δ是由四个亚基组成的异源四聚体：催化大亚基p125、小亚基p50、以及另外两个辅助亚基p68和p12。前期的研究发现，在损伤试剂处理或射线诱导而引起 DN A损伤的情况下，最小亚基p12在ATR/Chk1通路调控下以泛素化依赖（ubiquitinylation-dependent）的形式经蛋白酶体降解，从而导致细胞内Polδ由原来的四聚体形式Po lδ4转换为三聚体Po lδ3以应对DN A损伤，并可能在随后的修复过程中起着重要作用。
　　研究表明，p12的降解可能受到多种E3介导的多泛素化途径的调控，但截止到目前，仅鉴定出两种E3连接酶，环指蛋白8（Ring Finger Protein8, RNF8）和CRL4Cdt2，它们均介导了以 p12为靶标的多泛素化修饰。有报道指出，p68亚基在体内也能够被泛素化和类泛素化修饰，但在应对DNA损伤的过程中，Polδ究竟有多少亚基、具体哪个亚基、被何种E2/E3系统所介导、是发生多泛素还是单泛素修饰等的详细机制均不是很清楚。
　　几乎所有主要的DN A修复途径、损伤避免机制和细胞周期检查点响应等过程都或多或少的受到泛素化和（或）类泛素化 SUMO修饰途径的调控。泛素化和 SUMO参与多种 DNA的修复过程，如跨损伤合成（Translesion Synthesis）、核苷酸切除（Nucleotide Excision）、同源重组（Homologous Recombination）等。基于泛素化修饰在各种DNA损伤修复途径中的重要作用，本论文研究拟对Polδ的四个亚基分别进行体外泛素化分析，为揭示Polδ的泛素化修饰在DN A损伤应答过程中的未知功能提供参考。
　　本研究应用昆虫-杆状病毒表达系统，通过制备具 E3连接酶活性的RNF8，结合外购的多种E2缀合酶，对Po lδ的四个亚基分别进行泛素化修饰的体外分析；同时通过外购的E2/E3系统-RAD6/RAD18，对Polδ各亚基也进行了初步的泛素化体外分析。结果表明，RNF8既可介导p50单泛素化修饰，又可介导p12亚基的多泛素化修饰，但不能介导p125亚基的泛素化。RAD6/RAD18作为E2/E3酶，在DN A基质的存在下，能够介导p50的泛素化修饰，类似条件下，RAD6/RAD18也可介导p12的单泛素化修饰。
　　人类疾病，特别是癌症疾病对人类的健康和生存构成重大威胁，是世界各国面临的最重要社会问题之一。通过本论文的研究，将进一步加深对Po lδ泛素化修饰调控的理解，探索涉及维持基因组稳定性和控制细胞有序分裂的新机制，为今后以Po lδ作为某些小分子抑制剂的潜在靶标，设计新的肿瘤诊断和治疗手段来抗击癌症疾病提供理论参考。

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第一部分 绪论

1.1 DNA聚合酶

1.1.1 真核生物DNA聚合酶δ简介

1.1.2 真核生物DNA聚合酶δ的亚基组成

1.1.3 不同亚基组成Polδ蛋白复合物的体外重组

1.1.4 不同亚基组成的Polδ复合体的酶学特性

1.1.5 体内形成缺失了p12的三聚体Polδ3-?12的多种途径

1.2 泛素简介

1.2.1 泛素蛋白的结构

1.2.2 泛素化修饰过程

1.2.3 泛素化修饰对细胞周期检查点和DNA损伤修复的调控

1.3 立题依据

1.4 研究内容与研究意义

1.4.1 研究内容

1.4.2 研究意义

第二部分 实验材料与方法

第一章 实验材料和主要仪器设备

1.1 菌种和载体

1.2 细胞培养相关试剂

1.3 工具酶及检测试剂盒

1.4 其他试剂及材料

1.5 蛋白及抗体

1.6 主要仪器设备

第二章 试剂的配制

2.1 分子克隆相关试剂

2.2 Western-Blot相关试剂

2.3 蛋白表达纯化相关试剂

第三章 实验方法

3 .1 PCR反应

3 .2 PCR产物纯化

3.3 双酶切反应

3.4 胶回收

3.5 连接反应

3.6 感受态细胞制备

3.7 连接产物的转化

3.8 小规模质粒提取

3.9 双酶切验证

3 .1 0 昆虫Sf-9细胞的培养复苏

3.11 Tn7转座子上的转座

3.12 Bacmid DNA提取

3.13 发生重组RNF8杆状病毒Bacmid DNA的PCR验证

3.14 RNF8病毒的制备与扩增

3 .1 5 p50病毒的活化与扩增

3.16 SDS-PAGE凝胶电泳分析

3.17 Western-Blot免疫印迹反应

3.18 RNF8和 p50重组病毒的检验

3.19 His-RNF8融合蛋白的表达与纯化

3.20 蛋白浓度测定

3.21 RNF8蛋白质谱鉴定

3 .2 2 His-p50融合蛋白的表达与纯化

3.23 体外泛素化反应系统

第三部分 结果与讨论

第一章 重组蛋白的制备

1.1 RNF8融合蛋白的制备

1 .2 p50融和蛋白的制备

第二章 RNF 8介导P olδ亚基的体外泛素化分析

2.1 RNF8介导p50亚基的体外泛素化分析

2.2 RNF8介导p12亚基的体外泛素化分析

2.3 RNF8介导p125亚基的体外泛素化分析

第三章 RAD6/RAD18系统介导Polδp50和p12亚基的体外泛素分析

3 .1 以p50为基质的泛素化反应

3 .2 以p12为基质的泛素化修饰反应

总结与展望

参考文献

致谢

在读期间参加课题和发表论文情况