AcPCNA互作蛋白的筛选和BmNPV-POL蛋白纯化方法的改进

摘要

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)，是重要的模式杆状病毒，关于它们的复制机制的研究，一直吸引着国内外研究者的目光。在真核生物DNA复制过程中，PCNA能够提高DNA聚合酶δ的持续合成能力，是一个关键辅助因子。经PCNA的生物系统发育树分析发现，仅有9种杆状病毒可以编码自身的PCNA，但它们的具体功能却不为人知。
　　AcMNPV的基因组能编码一种类似增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA）的蛋白，其命名为AcPCNA。在瞬时复制实验中却发现AcPCNA不是AcMNPV DNA复制所必需的因子。为了进一步揭示AcPCNA的功能，本实验根据GenBank中提供的AcMNPV的PCNA基因序列，成功构建重组原核表达质粒pET30a-AcPCNA，经IPTG诱导表达，Western Blot成功检测到目的蛋白。经Ni-NTA柱浓度梯度洗脱和Mono Q离子交换层析柱纯化得到大量的His-AcPCNA，利用SuperoseTM6分子筛推测在非变性条件下的AcPCNA的分子量约为100 kDa，而预测分子量为30.7 kDa，说明AcPCNA很可能是以三聚体的形式表达装配。纯化的AcPCNA超滤浓缩后与CNBr-activated Sepharose4B耦联制备亲和层析柱，收集野生型（wild type, wt）AcMNPV感染的Sf-9细胞，超声裂解，低温高速离心后，得到的总蛋白液通过AcPCNA耦联亲和层析柱，洗脱馏分经质谱鉴定总共查找到12种可能与AcPCNA的存在互作的蛋白。其中包括Sf-9细胞与核糖体组成以及蛋白合成相关的Ribosomal protein L3和Actin等蛋白，还包括AcMNPV的LEF3、p48 protein等蛋白。亲和层析与质谱联用查找AcPCNA的互作蛋白，对于了解病毒的DNA修复机制非常有意义。为进一步研究和改造杆状病毒奠定了重要的生物学基础，也为生物防治研究生产新型生物杀虫剂提供理论支持，从而提高农作物经济效益。
　　本实验还成功构建了供体质粒pFastBacHTb-AcPCNA，利用MultiBac杆状病毒表达系统获得重组Bacmid，转染Sf-9细胞制备重组病毒，表达获得翻译修饰后的AcPCNA，并通过Poly(dA)/Oligo(dT)酶活分析检测其对BmNPV-POL的聚合酶活性影响，并未发现刺激活性。说明BmNPV-POL表现为AcPCNA非依赖性。
　　由BmNPV ORF53编码的家蚕核型多角体病毒DNA聚合酶（BmNPV-POL）在病毒的复制传代过程中扮演着重要的角色，而国内外对BmNPV-POL的研究较少，无法获得大量高纯度的活性蛋白可能是原因之一。本实验通过设计引物PCR改造已有的pFastBacHTc-BmNPV-POL-His表达载体，将C-端的His标签换成Strep标签，利用Strep Tactin（修饰的链球菌抗生素蛋白）亲和层析柱纯化，经抗Strep多克隆抗体Western Blot检测得到与预测分子量一致的蛋白。通过Poly(dA)/Oligo(dT)酶活分析测定其活性，结果显示有较高酶活性。通过比较改造前后融合蛋白的纯化效果发现，Strep Tactin亲和层析柱一步纯化即可得到大量的高纯度的BmNPV-POL，为后续实验提供充足的研究材料。此方法操作简单，蛋白损失较少，为大量制备BmNPV-POL提供一种新的方法，推进BmNPV-POL的研究发展。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

第一章 文献综述

1.1 杆状病毒的研究概述

1.2 模式杆状病毒的介绍

1.3 PCNA的概述

1.4 标签蛋白融合技术

1.5 立题依据

1.6 研究目的和意义

第二章 材料和方法

2.1 实验材料

2.2 主要仪器设备

第三章 杆状病毒AcPCNA蛋白氨基酸序列的生物信息学分析

3.1 应用软件及分析方法

3.2 结果与讨论

3.3 小结

第四章 AcPCNA在原核细胞内表达及纯化

4.1 方法

4.2 结果与讨论

4.3 小结

第五章 AcPCNA对BmNPV-POL的影响

5.1 方法

5.2 结果与讨论

5.3 小结

第六章 AcPCNA互作蛋白的查找

6.1 方法

6.2 结果与讨论

6.3 小结

第七章 BmNPV-POL纯化方法的改进

7.1 方法

7.2 结果与讨论

7.3 小结

总结与展望

参考文献

致谢

硕士期间学术研究成果