胃癌细胞来源exosome重塑微环境细胞作用及机制

摘要

目的：探讨胃癌细胞旁分泌外泌体（exosome）促进骨髓间质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC）转分化的重要作用和途径，阐明其诱导BMMSC转分化的分子机制,为胃癌微环境细胞重塑提供新的实验依据。
　　方法：采用Nanosight检测分析exosome直径大小、数量并验证Rab27a-siRNA干扰组肿瘤细胞培养上清中exosome的量；透射电镜检测exosome形态和直径大小；Western blot检测exosome特异性标记CD81、CD9蛋白的表达。免疫荧光检测诱导前后BMMSC中α-SMA的表达，Transwell迁移实验检测胃癌细胞SGC-7901、HGC-27迁移能力的改变，定量PCR检测比较诱导前后BMMSC中相关因子的表达和miR-4669表达的差异。采用Rab27a-siRNA抑制exosome分泌，免疫荧光和Transwell迁移实验检测Rab27a干扰的胃癌细胞上清诱导后 BMMSC表型和功能的改变，评估 exosome的诱导作用。运用miR-4669 micmis在胃癌细胞中上调 miR-4669的表达，分析转染miR-4669 micmis的SGC-7901和HGC-27上清及exosome分别作用BMMSC后其表型、功能的变化，确定miR-4669对BMMSC向胃癌间质干细胞（gastric cancer tissue-derived MSC，GC-MSC）转分化的调控作用。体外血管生成试验评价miR-4669过表达组BMMSC对血管形成能力的影响。定量PCR检测转染miR-4669mimics的胃癌细胞上清或 exosome诱导后 BMMSC相关基因表达变化，分析胃癌细胞来源的exosome通过miR-4669重塑BMMSC向GC-MSC转化的分子机制。
　　结果：免疫荧光和 Transwell迁移试验结果显示，胃癌细胞来源的 exosome可再现胃癌细胞上清的作用，诱导 BMMSC使其获得GC-MSC样表型和功能，α-SMA表达显著增强，且诱导后 BMMSC具有更强的促进胃癌细胞迁移的能力。通过转染Rab27a-siRNA抑制胃癌细胞 exosome的分泌，与对照组相比，干扰组诱导后 BMMSC的基质细胞活化表型和促进胃癌细胞迁移的能力均显著减弱。qRT-PCR结果显示，胃癌细胞来源exosome作用BMMSC后miR-4669表达水平较对照组显著上调。与对照组相比，转染miR-4669 mimics的胃癌细胞上清和 exosome诱导后的 BMMSC显示出增强的基质细胞活化表型和促进胃癌细胞迁移的能力，且转染miR-4669 mimics的胃癌细胞上清诱导后的BMMSC具有更强的促进血管生成能力。转染miR-4669mimics的胃癌细胞上清或exosome诱导后BMMSC相关基因检测结果显示，miR-4669的靶基因RXRA以及pri-4669、pre-4669的表达并无显著变化，而成熟的 miR-4669表达上调，且相关炎性因子CCL2、IL-6、IL-8表达上调。
　　结论：胃癌细胞分泌的 exosome是胃癌细胞培养上清中诱导BMMSC向GC-MSC转化的重要组分，其富含的miR-4669可被直接递送至BMMSC中，进而促使其获得GC-MSC样表型和功能，是介导胃癌细胞旁分泌作用BMMSC的关键信号分子。为MSC在胃癌微环境中的改造与重塑提供了新的机制。

目录

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图表目录

英文缩略词中英文注释表

第一章 绪论

1.1 间质干细胞与肿瘤微环境

1.2 Exosome与肿瘤

1.3 miRNA与肿瘤微环境

第二章 研究目的、方法、实验方案及意义

2.1 研究目的

2.2 研究方法

2.3 实验方案

2.4研究意义

第三章 胃癌细胞来源exosome诱导BMMSC向GC-MSC转分化

3.1材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

第四章 Rab27a-siRNA干扰胃癌细胞后exosome降低其转分化作用

4.1材料

4.2方法

4.3 结果

4.4 讨论

第五章 胃癌细胞exosome 携载miR-4669在BMMSC转分化中的作用

5.1材料

5.2方法

5.3 结果

5.4 讨论

第六章 结论和展望

6.1 结论

6.2研究创新点

6.3 展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文及参加会议