Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶分泌机制的研究

摘要

蛋白质的分泌是一个重要的生理学活动。蛋白质的分泌途径分为经典分泌途径（内质网-高尔基体途径）和非经典分泌途径。目前，蛋白质分泌的研究成果并不显著，已知的分泌蛋白非常有限，且它们的分泌途径和分子机制也还不明确。随着研究的深入，已发现有些分泌蛋白并不属于既定的经典分泌蛋白或非经典分泌蛋白，这些发现将对蛋白分泌的研究具有重要意义。
　　II型cGMP依赖性蛋白激酶（Type II cGMP-dependent protein kinase，PKG II）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其在肿瘤组织和肿瘤细胞株的表达和活性很低，研究发现它与肿瘤的发生发展有着密切关系。本研究利用Western blotting检测发现PKG II存在于腺病毒Ad-PKG II感染的胃癌细胞株HGC-27和宫颈癌细胞株Hela的上清中；利用ELISA检测发现PKG II也存在于人和小鼠血清中。上述结果明确了PKG II是分泌蛋白。
　　本课题接着深入研究PKG II的分泌途径。利用软件SignalP4.1 Server分析PKG II的氨基酸序列，结果发现PKG II并无经典信号肽序列，提示PKG II应该属于非经典分泌蛋白。采用激光共聚焦观察到PKG II与HGC-27细胞溶酶体标记物溶酶体相关膜蛋白1（lysosome-associated membrane protein1，LAMP1）不发生共定位，且发现PKG II并不存在于外泌体中，这说明PKG II并不通过这两种非经典分泌途径—溶酶体途径和外泌体途径分泌。鉴于PKG II在细胞内的分布与内质网和高尔基体分布相似，于是利用激光共聚焦观察到HGC-27细胞与人小肠中PKG II与内质网标记蛋白葡萄糖6磷酸酶(glucose-6-phosphatase，G-6-Pase)/高尔基体标记蛋白顺式高尔基体基质蛋白（130 kDa cis Golgi matrix protein，GM130）都有共定位。为进一步证明PKG II是经过内质网-高尔基体途径，进行了如下实验：利用特异性阻断内质网-高尔基体途径的抑制剂布雷菲尔德菌素(brefeldin A， BFA)来进行体内和体外实验，通过ELISA检测发现BFA能够阻断细胞内和小鼠体内PKG II的分泌；利用免疫共沉淀法检测到PKG II与内质网腔蛋白葡萄糖调节蛋白78(78 kDa glucose-regulated protein，GRP78)是相互结合的；采用肽N-糖苷酶F酶解法发现酶切组的PKG II的分子量有所减小，表明细胞内的PKG II经历N-糖基化修饰；提取细胞中的高尔基体检测发现PKG II存在于高尔基体内。上述结果证明了PKG II是经过经典途径分泌。
　　本课题进一步探讨了PKG II进入内质网的机制。鉴于PKG II是豆蔻酰化蛋白，将PKG II N端的甘氨酸突变成不能被豆蔻酰修饰的丙氨酸，发现2位甘氨酸的突变就能改变PKG II在细胞内的分布；构建腺病毒Ad-PKG II-G2A，检测培养上清中它的含量及与细胞内质网/高尔基体的共定位，结果发现，细胞不分泌2位突变的PKG II，且它也不与内质网/高尔基体共定位，即它不再经过这条途径分泌。以上的研究表明PKG II的豆蔻酰修饰能影响它的分泌，而蛋白的豆蔻酰修饰由豆蔻酰转移酶引起，于是本课题研究豆蔻酰转移酶1(myristoyl CoA:protein N-myristoyltransferse1，NMT-1)与PKG II的关系。利用免疫共沉淀法检测到PKG II与NMT-1是相互结合的；利用激光共聚焦观察到在HGC-27细胞内以及人胃肠标本中PKG II与NMT-1具共定位关系。为进一步证明PKG II的豆蔻酰修饰能影响它的分泌，再采用豆蔻酰转移酶抑制剂Tris(dibenzylideneacetone)–dipalladium(DBA)和2-Hydroxymyristic Acid（HMA）进行体内和体外实验。体内外实验显示，注射抑制剂组，PKG II在小鼠血清和HGC-27上清中的含量显著下降，表明PKG II的豆蔻酰修饰能影响小鼠体内和细胞中PKG II的分泌。基于实验结果和文献推测，PKG II的2位甘氨酸的豆蔻酰化能影响合成的新生肽的疏水性，从而影响它与内质网膜结构的结合，进而影响它进入内质网-高尔基体分泌途径。
　　本课题还要明确影响PKG II分泌的氨基酸序列。信号识别颗粒54（signal recognition particle54，SRP54）与信号肽序列的识别是引导新生肽到内质网关键的一步。本课题采用siRNA干扰细胞中SRP54的表达，结果表明PKG II的分泌受SRP54的影响。再检测到PKG II与SRP54是相互结合的，提示PKG II确实存在一段序列供SRP54识别并结合。在保留2位甘氨酸的基础上，对PKG II的N端进行序列逐一敲除实验，构建7个缺失体，结果显示转染PKG II-Del3-30-flag质粒的细胞不分泌PKG II，且PKG II不与GM130发生共定位。再利用免疫共沉淀法检测到缺失3-30位氨基酸的PKG II与SRP54的结合能力大幅减弱。以上结果表明PKG II通过3-30位氨基酸这段序列与SRP54识别并结合，进而引导其进入内质网-高尔基体途径分泌。
　　本课题最后要明确在PKG II中发挥信号肽作用的序列。结合PKG II的2位甘氨酸豆蔻酰修饰以及3-30位氨基酸的作用，利用免疫共沉淀检测PKG II-flag、PKG II-Del3-30-flag和PKG II-G2A-flag三种质粒表达后与SRP54的结合能力，结果显示在转染缺失3-30位氨基酸或者2位甘氨酸突变的质粒的细胞内，PKG II和SRP54的结合大幅减弱，且程度相似。这表明，PKG II的2-30位氨基酸很可能发挥信号肽序列的作用。鉴于起始氨基酸的作用，于是构建PKG II的1-30位氨基酸的质粒和肽段去分别进行验证，免疫沉淀结果发现在IP组能检测到SRP54，表明PKG II-N30AA能结合SRP54，且IP组的SRP54含量为PKG II-Myr-N29AA-flag多肽组>PKG II-N30AA-flag多肽组>PKG II-N30AA-flag多肽组+HMA，这进一步表明，豆蔻酰化的PKG II-N30AA更利于它与SRP54的结合，也就是更利于它的分泌。从而确定了PKG II2位甘氨酸的豆蔻酰修饰以及3-30位氨基酸序列共同发挥信号肽的作用。本课题还探究了这段序列能否引导异源蛋白的分泌。结果显示，在转染PKG II-N30AA-GFP质粒组，GFP的分布发生改变，且与GM130发生明显共定位。这也验证了PKG II-N30AA能作为信号肽序列引导GFP进入内质网-高尔基体途径分泌。
　　本研究还从上百种豆蔻酰化蛋白中选择了一些在细胞中表达较高的蛋白来检测它们的分泌情况，结果发现，瓣状内切核酸酶1（flap endonuclease1，FEN1）和cAMP依赖性蛋白激酶（cAMP-dependent protein kinase，PKA）属于分泌型豆蔻酰化蛋白，而肉豆蔻酰化丙氨酸丰富蛋白激酶C底物（Myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate， MARCKS）和丝氨酸/苏氨酸PI3K调节亚基4（The serine/threonine phosphatidylinositide3-kinase regulatory subunit4， PIK3R4/Vps15）以及2'-5'-寡腺苷酸合成酶2（2'-5'-oligoadenylate synthetase2， OAS2）为非分泌型豆蔻酰化蛋白，其中，内皮一氧化氮合酶（nitric oxide synthase3，NOS3）为选择性分泌蛋白。表明蛋白的分泌机制是很复杂的，豆蔻酰修饰可能只是豆蔻酰化蛋白分泌的条件之一，应该还与其氨基酸序列相关。采用siRNA干扰SRP54的表达，发现随着SRP54的表达降低，细胞上清中FEN1和PKA的含量明显减少。结果表明，FEN1和PKA的分泌受SRP54的影响。表明可以效仿PKG II分泌机制的研究方法，深入研究FEN1和PKA，为豆蔻酰蛋白分泌的研究做铺垫。
　　综上所述，PKG II为分泌蛋白，通过2位甘氨酸的豆蔻酰修饰和3-30位氨基酸序列共同发挥信号肽作用，从而被 SRP54识别并结合，进而引导其进入内质网-高尔基体途径分泌。

目录

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英文缩写索引

第一章 绪论

1.1 蛋白质的分泌途径

1.2 新型分泌蛋白

1.3 PKG II研究的新发现

1.4 研究目的和研究意义

1.5 研究内容、方法和技术路线

第二章 PKG II分泌途径的确定

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

第三章 PKG II的豆蔻酰修饰与分泌的关系

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

第四章 影响PKG II分泌的氨基酸序列确定

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果

4.4 讨论

第五章 PKG II中发挥信号肽作用的序列确定

5.1 材料

5.2 方法

5.3 结果

5.4 讨论

第六章 结论与展望

6.1 主要结论

6.2 展望

参考文献

致谢

攻读博士期间已发表文章