miR-625-5p靶向Akt2负调控脂多糖诱导的支气管上皮细胞的炎症反应

摘要

背景与目的：
　　支气管哮喘是由多种细胞和细胞组分参与的一种常见的气道慢性炎症性疾病。随着研究的不断深入，支气管上皮细胞在哮喘的发生发展过程中的作用越来越受到人们的重视。微小RNA（miRNA）是一类高度保守的非编码RNA，主要通过靶向mRNA的3’非编码区(3’UTR)发挥作用。大量研究发现miRNA在哮喘的免疫反应、炎症反应、气道高反应性、气道重塑等过程中发挥着重要的作用，但是其对支气管上皮细胞炎症的作用却知之甚少。本实验旨在通过脂多糖（LPS）诱导支气管上皮细胞系（16HBE）构建体外炎症模型，研究miR-625-5p对LPS诱导的16HBE细胞炎症的调节作用及其可能的机制。
　　方法：
　　1、LPS诱导16HBE细胞炎症模型的构建
　　1.1以不同浓度LPS(0，0.01，0.1，1，10，100 mg/L)刺激16HBE细胞12小时后， MTT法检测细胞活力的变化。
　　1.2 LPS（1mg/L）刺激16HBE细胞12小时，实时荧光定量PCR法检测IL-6、TNF-α的mRNA相对表达量。
　　2、miR-625-5p的上调或下调对LPS诱导旳16HBE细胞炎症反应的影响
　　分别转染miR-625-5p mimic或miR-625-5p inhibitor16HBE细胞24小时，实时荧光定量PCR法检测miR-625-5p的mRNA相对表达量。将转染过的细胞LPS刺激12小时，实时荧光定量PCR法分析IL-6、TNF-α的mRNA水平上的变化；酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测IL-6、TNF-α蛋白水平的变化。
　　3、miR-625-5p与其靶基因关系的验证
　　分别共转染 Akt2的3’UTR野生型质粒（pMIR-Akt2-WT）＋miR-625-5p mimic/control及 Akt2的3’UTR突变型质粒（pMIR-Akt2-MU）＋miR-625-5p mimic/control16HBE细胞48小时后，双荧光报告基因检测系统分析荧光素酶活性的变化。
　　4、miR-625-5p抑制LPS诱导的炎症反应的分子机制
　　分别转染miR-625-5p mimic/miR-625-5p inhibitor及其相应的control24小时后， 用LPS刺激16HBE细胞12小时，Western Blot法检测p-Akt2、Akt2、p-IκBα的蛋白表达水平。
　　结果与结论：
　　1、LPS能诱导16HBE细胞炎症模型
　　1.1与对照组相比，0.1mg/L以上浓度的LPS能显著抑制16HBE细胞的活力。
　　1.2与对照组相比，细胞炎症因子IL-6和TNF-α的mRNA相对表达量显著上调。
　　以上结果表明LPS成功诱导16HBE细胞炎症模型。
　　2、miR-625-5p对LPS诱导旳16HBE细胞炎症反应起到一定的抑制作用
　　2.1转染miR-625-5p mimic后，细胞内miR-625-5p的mRNA表达量明显上调。将转染过的细胞LPS刺激12小时，发现16HBE细胞IL-6、TNF-α的mRNA水平及蛋白水平均显著下降。
　　2.2转染miR-625-5p inhibitor后，细胞内miR-625-5p的表达明显下调。将转染过的细胞LPS刺激12小时，发现16HBE细胞IL-6、TNF-α的mRNA水平及蛋白水平均显著升高。
　　以上结果提示miR-625-5p能抑制LPS诱导的支气管上皮细胞炎症因子的释放和表达。
　　3、miR-625-5p能靶向抑制Akt2
　　将miR-625-5p mimic与pMIR-Akt2-WT/pMIR-Akt2-WU转染细胞后，发现miR-625-5p可明显降低pMIR-Akt2-WT荧光素酶活性，而对pMIR-Akt2-WU荧光素酶活性无抑制作用。提示miR-625-5p可与Akt2结合并抑制其蛋白表达。
　　4、miR-625-5p抑制LPS诱导的Akt2和IκBα蛋白的磷酸化水平。
　　与对照组相比，LPS组 p-Akt2、p-IκBα的蛋白表达水平明显升高；与 LPS组相比，miR-625-5p mimic组 p-Akt2、p-IκBα的蛋白表达水平明显降低，而miR-625-5p inhibitor组明显升高。表明miR-625-5p可抑制LPS诱导的Akt2和IκBα蛋白的磷酸化水平。
　　本研究通过LPS刺激16HBE细胞构建炎症模型，进一步用miR-625-5p进行干预，发现miR-625-5p可能是通过靶向Akt2，进而调控NF-κB信号通路，抑制细胞炎症因子的释放，负向调控LPS诱导的炎症反应。

目录

声明

英文缩略词

第一章 绪论

第二章 miR-625-5p对LPS诱导的炎症反应的作用

第一节 LPS诱导的16HBE细胞炎症模型的建立与验证

1 材料与方法

2 结果

3 结论

4 讨论

第二节 miR-625-5p对LPS诱导的16HBE细胞炎症的影响

1 材料与方法

2 结果

3 结论

4 讨论

第三章 miR-625-5p抑制LPS刺激的16HBE细胞炎症反应的分子机制

第一节 miR-625-5p与靶基因Akt2关系的验证

1 材料与方法

2 结果

3 结论

4 讨论

第二节miR-625-5p抑制LPS诱导的炎症反应的分子机制

1 材料与方法

2 结果

3 结论

4 讨论

第四章 总结

参考文献

第六章 综述: PKB/Akt在支气管哮喘中的研究进展

攻读硕士期间发表的论文

致谢