间充质干细胞移植治疗系统性红斑狼疮骨质疏松的在体研究

摘要

目的：
　　研究同种异体骨髓间充质干细胞（BMMSCs）移植对狼疮鼠和系统性红斑狼疮（SLE）患者骨质的影响，并研究其机制，为BMMSCs移植治疗SLE骨质疏松提供依据。
　　方法：
　　(1)利用代谢笼留取各组8、12、16、20周小鼠24小时尿液。比较各组尿蛋白的变化以及差异。
　　(2)实验分组：1)正常对照组，2) PBS对照组：12周注射PBS狼疮鼠组，3)一次BMMSCs移植组：12周注射BMMSCs狼疮鼠组，4)两次PBS组：12和16周均注射PBS狼疮鼠组，5)两次BMMSCs移植组：12和16周均注射BMMSCs狼疮鼠组。分离各组小鼠股骨，HE染色观察小鼠骨组织小梁的情况，同时用免疫组织化学法检测各组骨组织P-Smad1//5/8蛋白的表达情况。
　　(3)全骨髓贴壁培养法分离各组小鼠BMMSCs，培养至第三代。定向诱导各组BMMSCs成骨分化，碱性磷酸酶和茜素红染色，分析比较各组BMMSCs的成骨分化能力，RT-PCR检测各组小鼠Runx2、NF-κB以及BMP/Smad信号通路各基因的mRNA的水平。
　　(4)留取小鼠外周血血清，用ELISA的方法检测各组小鼠骨代谢指标骨形成蛋白-2(BMP-2)、骨钙素(OCN)、核因子κB受体活化因子配体(RANKL)、骨保护素(OPG)的水平，计算并比较OPG/RANKL比值。
　　(5)留取同种异体移植脐带间充质干细胞(UCMSC)的SLE患者移植前后外周血，检测移植前后各标本骨代谢指标BMP-2、OCN、OPG、RANKL、总Ⅰ型前胶原氨基端肽(t-PINP)、Ⅰ型胶原羧基端肽(β-CTX)的水平，比较移植前后的变化。
　　(6)分离移植前后SLE患者的外周血单个核细胞，RT-PCR检测Runx2、NF-κB以及BMP/Smad信号通路各基因的mRNA的水平。
　　结果：
　　(1) MRL/lpr小鼠尿蛋白水平较正常对照组小鼠C57BL/6明显增加，BMMSCs移植后，一次和两次移植组尿蛋白定量均有所减少，且两次移植组在20周时较一次移植组尿蛋白水平低(P＜0.05),但均无法减少至正常水平。
　　(2)狼疮鼠骨组织骨小梁排列紊乱，骨小梁面积减少(P＜0.05)，移植BMMSCs后，一次和两次移植组骨小梁面积均有所增加(P＜0.05)，两组间无差异；骨组织免疫组化显示：狼疮鼠表达P-Smad1/5/8蛋白的成骨细胞数目明显减少，而移植以后，有所增加，但不及正常对照组小鼠。
　　(3)狼疮鼠BMMSCs的ALP活性和形成矿化结节的能力减弱(P＜0.01)，Runx2基因表达下降(P＜0.01)，BMP/Smad信号通路中BMP2和Smad1基因mRNA表达下降(P＜0.01)，TNF-α、NF-κBp50和NF-κBp65基因mRNA表达增高(P＜0.01)；BMMSCs移植后狼疮鼠BMMSCs BMP2基因水平升高(P＜0.05)，TNF-α基因水平下降(P＜0.05)、NF-κBp50和NF-κBp65基因水平显著下降(P＜0.01)。
　　(4)狼疮鼠血清BMP-2、OCN、OPG水平较正常对照组明显减低(P<0.001)，RANKL水平显著增加(P＜0.001)，移植后BMP2、OPG、OCN水平较移植前明显升高(P<0.01)， RANKL水平较移植前明显减低(P<0.01)。
　　(5)移植后SLE患者血清BMP-2、t-PINP水平较移植前增加(P＜0.05)，RANKL水平较移植前减低(P＜0.05)，β-CTX、OCN、OPG水平无明显改变。
　　(6)移植后SLE患者TNF-α、NF-κBp50和NF-κBp65 mRNA水平下降(P＜0.05)， Runx2、BMP2、Smad1、Smad5和Smad8 mRNA水平无变化。
　　结论：
　　狼疮鼠发病后存在骨质疏松。狼疮鼠BMMSCs的成骨分化能力减弱，间充质干细胞移植可部分改善狼疮患者和狼疮鼠的代谢指标，改善狼疮鼠骨质疏松状态；BMMSCs移植可能是通过调节BMMSCs的BMP及NF-κB信号通路来改善骨代谢状况的。

目录

声明

常用缩略词对照表

第一章 引 言

第二章 间充质干细胞移植治疗狼疮鼠和狼疮病人继发性骨质疏松机制的在体研究

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验设计方案

2.4 统计学方法

第三章 实验结果

3.1 各组小鼠尿蛋白水平的变化

3.2 各组小鼠骨组织骨质的变化

3.3 各组小鼠血清骨代谢指标变化

3.4 各组小鼠BMMSCs成骨分化能力的变化

3.5 各组小鼠骨代谢BMP/Smad以及NF-κB信号通路相关基因的变化

3.6 各组小鼠骨组织免疫组化变化

3.7 狼疮患者UC-MSCs移植前后人外周血单个核细胞TNF-α基因以及骨代谢相关基因变化

3.8 狼疮患者UC-MSCs移植前后外周血中骨代谢指标的变化

第四章 讨 论

第五章 结 论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文

综述: 系统性红斑狼疮的骨质疏松概述