助眠天然活性成分丁香酸脂质体的制备及体内外评价研究

摘要

睡眠是人体重要的生理功能，高质量而充足的睡眠可以有效恢复人体机能。睡眠由中枢神经系统发生并受之调控，同时也受机体与外界多种因素影响。随着现代社会压力的不断增加，失眠现象普遍发生，失眠发病率逐年提高，严重影响着人们的工作生活。西医药物治疗主要为镇静催眠药，存在较大的副作用，如安全性低、依赖性、成瘾性和戒断性等，因而其应用受到限制。近年来研究发现，许多天然药物（中药组方、中药提取物、中药活性成分及天然活性单体）具有良好的镇静催眠作用，而且副作用小，具有良好的开发研究价值。因此，本课题从传统中药中探寻具有改善睡眠作用的活性物质，并对活性成分的纳米制剂进行研究。
　　第一章综述
　　本章对天然药物治疗失眠的研究现状进行综述，重点总结分析了近10年来天然来源的镇静催眠单体及其作用机制的研究进展，展望了镇静催眠中药单体的研究新方向。随着天然产物研究的不断深入，从天然产物中寻找天然助眠活性成分将成为今后失眠研究的重要方向。
　　第二章助眠天然药物 JD-XM1提取工艺及活性部位药效研究
　　本章以药效跟踪法，从天然药物 JD-XM1中筛选镇静催眠活性部位，并对活性部位药效进行评价。单因素法筛选 JD-XM1的提取工艺，优选提取工艺为：乙醇浓度70%、提取温度90℃、提取时间2 h、液固比12：1。JD-XM1提取物依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯及正丁醇萃取，以阈剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠试验评价各极性部位药效，与空白组相比，正丁醇组部位能够显著缩短睡眠潜伏期（182.7±7.6 vs227.7±29.7 s，P<0.01），延长睡眠时间（5518.7±1558.3 vs2265.8±606.0 s，P<0.01）。小鼠自主活动试验和 PCPA致小鼠失眠模型评价 JD-XM1正丁醇部位药效，结果表明，正丁醇部位能够显著减少活动距离（P<0.01）和活动时间（P<0.05），且呈现剂量相关性。正丁醇部位可恢复PCPA导致的小鼠失眠行为，与模型组相比，正丁醇部位（300 mg/kg）可缩短戊巴比妥钠诱导的睡眠潜伏期，延长睡眠时间（P<0.01）。
　　第三章 JD-XM1助眠活性成分的筛选及其结构分析研究
　　本章采用活性跟踪法，从 JD-XM1的正丁醇活性部位中，系统分离纯化具有镇静催眠作用的活性单体，并进行结构解析。采用硅胶层析柱对 JD-XM1正丁醇活性部位进行分离纯化，得到多种流分。阈剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠试验筛选，发现 Fr6流分（二氯甲烷：甲醇=2:1）能够缩短戊巴比妥钠诱导的睡眠潜伏期，延长睡眠时间。C18柱对 Fr6继续纯化，得到白色粉末 Compound A，通过 NMR和 MS进行结构鉴定，为3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸（丁香酸）。镇静催眠药效实验显示，高剂量丁香酸（200 mg/kg）能够显著延长戊巴比妥钠诱导的睡眠时间（P<0.01），缩短睡眠潜伏期（P<0.05），并呈现剂量相关性。
　　第四章丁香酸脂质体的制备及其体外评价
　　针对本文筛选出来的 JD-XM1活性成分丁香酸，本章建立了 HPLC丁香酸的体外分析方法，并进行了方法学考察。结果表明，建立的体外分析方法，系统适用性好，制剂辅料对分析无干扰；在0.5-100μg/mL范围内线性关系良好；48 h内稳定性良好；方法日内/日间精密度高（RSD<2%）；方法回收率高，可用于丁香酸的定量分析。平衡溶解度实验表明，丁香酸在各种介质中的溶解度均较低，在 pH7.4磷酸缓冲液中的溶解度最大，但仅为78.82±4.68μg/mL，而在水和 pH1.2盐酸溶液中的溶解度接近，分别为66.05±2.65μg/mL和66.86±2.19μg/mL，表明丁香酸的溶解度较差。此外，油水分配系数测定表明，丁香酸log P为1.31，表明丁香酸口服后不易在胃肠道内吸收。以薄膜分散法制备丁香酸脂质体，单因素法筛选处方，优选处方为丁香酸100 mg，大豆磷脂1200 mg，胆固醇200 mg，胆酸钠800 mg，肉豆蔻酸异丙酯800 mg，水化介质为20 mL的PBS（pH7.4），制得的丁香酸脂质体澄清，包封率高（82.20±2.30%）。体外表征表明，制备的丁香酸脂质体呈类球形，分布均匀，平均粒径为154.67±7.09 nm，粒径分布较窄，分散性系数（PDI）为0.14±0.04，Zeta电位为-27.61±3.65 mV。稳定性试验表明，丁香酸脂质体15天稳定性良好，未出现明显的絮凝或浑浊现象，且包封率未有明显变化。
　　第五章丁香酸脂质体大鼠体内药动学及小鼠组织分布研究
　　本章以 HPLC建立了测定大鼠血浆及小鼠组织中丁香酸含量的体内分析方法，并进行了方法学考察。在不同生物样品中，线性均良好（r2>0.99），日内、日间精密度均小于5%，样品回收率良好，符合体内药物检测的方法学要求。丁香酸脂质体的大鼠药动学研究表明，丁香酸脂质体可以提高口服生物利用度。与丁香酸原料药相比，丁香酸脂质体提高了 Cmax，给药95 min之后的血药浓度均高于原料药（1.81±0.94 vs0.12±0.03μg/mL），表明脂质体能够增加药物吸收，且延缓了丁香酸在体内的消除；t1/2显著延长（116.67±14.40 vs25.36±1.99 min），平均滞留时间显著延长（286.27±18.32 vs37.98±1.02 min），说明脂质体能够延长丁香酸在体循环时间；丁香酸脂质体显著提高了口服生物利用度，药时曲线下面积AUC0-360min显著提高，为原料药的237.30%。丁香酸脂质体的小鼠组织分布研究表明，丁香酸原料药在血浆中的浓度随着时间的延长快速下降，而脂质体在0.5 h和2 h的血药浓度均显著高于原料药，说明脂质体能够减缓药物消除过程，延长药物在体时间；丁香酸及丁香酸脂质体在各组织器官中药物浓度大小依次为：肾>肝>肺>脾>心>脑，均趋向于向肾、肝分布；脑部能够检测到丁香酸，说明丁香酸能够透过血脑屏障（BBB），脂质体可减缓药物在脑部的消除，延长药物在脑部的滞留时间，以发挥镇静催眠作用。

目录

声明

引言

第一章 综述

1.1 失眠治疗概述

1.2 中药单体治疗失眠研究进展

1.3 镇静催眠中药单体研究新方向

1.4 论文工作的提出

第二章 助眠天然药物 JD-XM1 提取工艺及活性部位药效研究

2.1 本章概述

2.2 仪器与试剂

2.3 实验方法

2.4 实验数据和结果讨论

2.5 本章小结

第三章 JD-XM1 助眠活性成分的筛选及其结构分析研究

3.1 本章概述

3.2 仪器与试剂

3.3 方法

3.4 实验数据和结果讨论

3.5 本章小结

第四章 丁香酸脂质体的制备及其体外评价

4.1 本章概述

4.2 仪器与试剂

4.3 方法

4.4 实验数据和结果讨论

4.5 本章小结

第五章 丁香酸脂质体大鼠体内药动学及小鼠组织分布研究

5.1 本章概述

5.2 仪器与试剂

5.3 方法

5.4 实验数据和结果讨论

5.5 本章小结

全文总结

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文目录及其他科研成果