帕瑞昔布钠对转移性皮肤癌痛小鼠模型ASIC3表达和作用的影响

摘要

癌痛作为一种慢性疼痛，严重影响着肿瘤患者的生存质量。癌痛有其自身 复杂而独特的机制。其中组织酸化是肿瘤导致疼痛及痛觉过敏的重要因素。疼痛信号产生于伤害性感受器的神经末梢，而这类感觉神经元亚群的细胞膜上存在各种离子通道及受体的表达，它们能感受细胞外伤害刺激，使其转变成动作电位并 介导疼痛的产生。酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels，ASICs)即为一类广 泛存在于感觉神经元细胞膜上的质子通道蛋白。本研究拟通过创建小鼠转移性皮肤癌痛模型，运用RT-PCR、Western blotting技术测定肿瘤生长期内不同时间点ASIC3在小鼠DRG上表达量的变化，并结合小鼠对疼痛刺激行为学上的表现，探 讨ASIC3与癌痛之间的关联。同时，研究帕瑞昔布钠对ASIC3的表达和活性的影响及其在癌痛中的治疗效果，旨在为临床癌痛治疗提供新的多模式镇痛方案并对其机理的研究提供新的佐证。 第一章小鼠转移性皮肤癌痛模型的创建 目的：创建小鼠转移性皮肤癌痛模型。 方法：24只Balb/c系小鼠（清洁级、雌性、8周龄、体重21?25g) 随机分为空 白对照组、假手术组、癌痛组共3组，每组8只。癌痛组用微量注射器于小鼠左后 趾皮下注射20^1 4T1乳腺癌细胞悬液(细胞数约2×105个)；假手术组以相同方式操作，注入PBS缓冲液；空白对照组无任何处理；观察各组小鼠肿瘤细胞接种前及 接种后第1至第11天一般情况、小鼠接种侧足趾外观、接种侧肢体活动和行走步 态的改变情况(行走疼痛评分)、热刺激缩爪潜伏期(PTWL)改变。 结 果 ：空白对照组与假手术组比较，建模后两组小鼠行为学行走疼痛评分和 PTWL无统计学差异（P>0.05 );与空白对照组、假手术组小鼠比较，癌痛组小鼠自肿瘤接种第4天起，接种侧足趾出现瘤体增大，行走疼痛评分表现为逐步增 高，差异有统计学意义（P<0.05)，接种后第7天起，PTWL表现为逐渐缩短， 差异有统计学意义（P<0.05);接种后第11天，癌痛组小鼠行走疼痛评分与PTWL都达到峰值（P<0.01)。接种第14天后，因部分小鼠瘤体过大，破溃、结痂，影响热板测试，实验终止。 结论：小鼠转移性皮肤癌痛模型创建成功。 第二章ASIC3在转移性皮肤癌痛小鼠脊髓DRG上表达的变化 目的：测定ASIC3在癌痛模型小鼠脊髓DRG上表达的改变。 方法：小鼠皮肤癌痛模型的创建方法与实验第一部分相同。建模后分别对空白对照组、假手术组、肿瘤接种后第5、8、11天组5组小鼠进行处死并摘取L4?5脊髓节段DRG组织，运用反转录聚合酶链式反应、蛋白质印记分析测定在肿瘤接种后不同时间内，小鼠脊髓DRG上 ASIC3mRNA和蛋白表达量的相对变化。 结果：空白对照组、假手术组两组比较，小鼠脊髓DRG神经元上ASIC3 mRNA、蛋白表达量差别无统计学意义（P〉0.05)；肿瘤接种后第5、8、11天组 3 组分别与空白对照组、假手术组比较，其小鼠脊髓DRG神经元上ASIC3 mRNA,蛋白表达量差别均有统计学意义（P<0.05)；且表达量随接种天数增加呈现逐渐增加趋势，肿瘤接种后第8、1 1天两组小鼠脊髓DRG神经元上ASIC3 mRNA、蛋白表达量增加趋势明显（P<0.01)。 结论：癌痛组小鼠4T1肿瘤细胞接种后，小鼠脊髓DRG神经元上ASIC3 mRNA、蛋白表达量随接种时间推移表现为逐渐增加。 第三章帕瑞昔布钠鞘内注射对转移性皮肤癌痛小鼠的镇痛作用 目的：研究帕瑞昔布钠鞘内注射对转移性皮肤癌痛小鼠的镇痛作用。 方法：小鼠转移性皮肤癌痛模型创建方法同实验第一章。32只 Balb/c系小鼠(清洁级、雌性、8周龄、体重22?25g)，建模后随机分成4组：对 照组 （鞘内注射NS 5μl)(A组）、20昭>L帕瑞昔布钠组（B组）、40昭>L帕瑞昔布钠组（C 组）、80μg/μL帕瑞昔布钠组（D 组），每组8只。于建模后第11天，分别对B 组、C 组、D 组小鼠进行相应剂量帕瑞昔布钠鞘内注射，A 组小鼠鞘内注射5μL生理盐水。于鞘内注射后第15、30、60、90、120、150、180min，分别进行热板测试，测定热刺激缩足潜伏期（PTWL)变化，并用反转录聚合酶链式反应、蛋白质印记分析测定各组小鼠脊髓DRG上ASIC3 mRNA和蛋白表达量的相应改变。 结果：与 A 组比较，鞘内注射后第60min，B 组、C 组、D 组小鼠PTWL均表现为明显延长，差异有统计学意义（P<0 . 05 )；鞘内注射后第120min，PTWL差异达峰值（P<0.01)。B 组、C 组、D 组三组组间相比差异有统计学意义(P<0.05 )，小鼠热痛觉过敏PWTL反应时间与鞘内注射帕瑞昔布钠浓度呈正相关关系。随着B 组、C 组、D 组銷内注射帕瑞昔布納浓度的升局，小鼠DRG上ASIC3 mRNA、蛋白表达量表现为逐渐下降。 结论：帕瑞昔布钠鞘内注射对转移性皮肤癌痛小鼠模型有镇痛作用。帕瑞昔布钠鞘内注射对转移性皮肤癌痛模型小鼠DRG上ASIC3 mRNA,蛋白表达的抑制作用与帕瑞昔布納浓度呈正相关，提示ASIC3在帕瑞昔布納銷内注射对转移性皮肤癌痛小鼠的镇痛机制中发挥重要作用。

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