基于循环肿瘤细胞的基因标志物对转移性前列腺癌的诊断价值

摘要

前列腺癌（PCa）是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤，占全球癌症发病第5位，前列腺癌在欧美发达国家的发病率位于男性恶性肿瘤的第一位。近年来，前列腺癌在我们国家的发病率呈显著的上升趋势，预计2020年，中国前列腺癌发病率将超过40/10 万男性人口，达到西方国家的水平，前列腺癌将是危害男性健康的主要癌症杀手。据统计，局限性的前列腺癌患者5年生存率几乎达到100%，但发生转移的前列腺癌患者5年生存率仅为29%左右。因此，降低初诊时转移性前列腺癌的患者比例以及对潜在转移的精确诊断将对提高患者的生存率至关重要。 目的 以中国转移性前列腺癌患者为研究对象，探究基于循环肿瘤细胞（CTCs）的前列腺癌相关基因标志物，解决前列腺癌早期诊断、治疗评估及个性化治疗这一重大临床需求，提高我国前列腺癌患者的总体5年生存率，为开发具有自主知识产权的前列腺癌诊断试剂盒提供科学依据。 方法 通过生物信息学比对和分析，获得14个与转移性前列腺癌相关的特异性高表达的备选基因，再利用前列腺癌细胞系(PC3, VCaP, LNCaP)，正常人血液和病人临床样本进行荧光定量PCR的验证，排除备选基因中在正常人血液中有表达的基因，最终获5个具有临床检验应用前景的前列腺癌特异性标志基因：KLK2、KLK3、FOXA1、GRHL2 和HOXB13。通过实时定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）技术对人前列腺癌细胞（LNCap）中五个基因的表达进行检测，建立多基因表达的联合检测的方法。采集转移性前列腺癌患者和健康志愿者的血液样本，对血液样本和人前列腺癌细胞对检测方法的一致性、重复性、线性和灵敏度方面进行了评估。通过比较患者血液样本中CTCs计数和基因表达结果，确定前列腺癌相关标志基因表达水平对于患者预后的意义。 结果 FOXA1, HOXB13, KLK2, KLK3, GRHL2 这 5 个基因可作为荧光定量RT-PCR法检测外周血中循环肿瘤细胞内前列腺癌的标志基因；联合检测方法中各基因表达水平与单基因表达水平具有一致性；五个基因表达量在LNCap RNA 不同稀释浓度（1 pg至1μg）的对数范围内呈现较明显的线性关系：KLK2（0.995）、KLK3（1）、FOXA1（0.992），GRHL2（0.999），HOXB13（1）；各基因检测浓度范围分别是KLK2（5 pg-1μg）、KLK3（1 pg-1μg）、FOXA1（10 pg-1μg）、GRHL2（100 pg-1μg）、HOXB13（100 pg-1μg）；患者血液样本中CTCs计数和基因表达结果对比显示二者具有相关性，即CTCs计数越高的患者，其基因表达阳性率也越高。 结论 FOXA1, HOXB13, KLK2, KLK3, GRHL2 这 5 个基因可作为荧光定量RT-PCR法检测外周血中循环肿瘤细胞内前列腺癌的标志基因，五个基因表达水平的联合检测方法具有操作更简单便捷的技术优势和较好的准确性和灵敏度，为进一步开发临床前列腺癌的预后指标提供新的思路和方法。

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摘 要

Abstract

前言

实验材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

结果

一、前列腺癌标志基因的筛选与验证

二、联合检测法和单一引物法对5种基因PCR扩增ΔCt值没有影响

三、联合检测方法具有线性相关性

四、5种基因的检测灵敏度实验.

五、联合检测方法重复性和检测限度

六、患者血液样本CTCs计数和组合基因表达水平结果比较

讨论

参考文献

综述

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文