阻燃剂TBBPA-DHEE和TBBPA-MHEE免疫分析方法研究及其在风险评估中的应用

摘要

四溴双酚A类阻燃剂（TBBPA）是溴代阻燃剂（Brominated flame retardants， BFRs）的一种，作为添加型阻燃剂广泛应用于电子产品、油漆、纺织品等日常生活中。TBBPA类物质通过各种途径进入环境介质中，对环境中的机体产生影响。研究发现TBBPA类化合物具有内分泌干扰毒性、神经毒性等，对环境生态与人体健康存在潜在风险。四溴双酚A双（2-羟基二乙）醚（TBBPA-DHEE）是TBBPA一种重要衍生物，四溴双酚A单（2-羟基二乙）醚（TBBPA-MHEE）是TBBPA-DHEE的副产物。传统的TBBPA类化合物检测分析方法多采用仪器分析方法，但样本前处理复杂、设备昂贵、需要专业操作人员，不适用于多样本量的检测。因此，急需建立一种高通量、低成本、耗时短的分析检测方法，为TBBPA类污染物在环境介质中的分布情况调查提供技术上支持。本研究以TBBPA-DHEE、TBBPA-MHEE为研究对象，设计并合成TBBPA-DHEE半抗原，制备并筛选单克隆抗体；采用同源模式以及异源模式，建立了三种ELISA方法，实现TBBPA-DHEE和TBBPA-MHEE特异性/同时识别；并对典型区域环境中TBBPA-DHEE、TBBPA-MHEE进行污染调查及风险评估。具体研究内容如下： （1）制备TBBPA-DHEE半抗原（D3）并进行鉴定，将半抗原与载体蛋白偶联制备免疫原D3-BSA和包被原D3-OVA。用D3-BSA免疫BALB/c小鼠，选取效价高且抑制效果好的小鼠，将小鼠的脾细胞与SP2/0进行融合，通过筛选与克隆制备了五株稳定分泌TBBPA-DHEE单克隆抗体的细胞株：D2D2、D2D4、D2D6、D4G6、F7D5。对其分泌的抗体进行类与亚型的鉴定，结果显示这五株单克隆抗体的重链均为IgG1型，轻链均为Kappa型。 （2）采用两种包被原D3-OVA和M3-OVA（前期研究制备）与五株单克隆抗体进行抗原-抗体配对分析，发现当以D3-OVA为包被原时，五株单克隆抗体均能够同时识别TBBPA-DHEE与TBBPA-MHEE；以M3-OVA为包被原时，D4G6株单克隆抗体能够特异性识别TBBPA-DHEE，而D2D6株单克隆抗体能够特异性识别TBBPA-MHEE。 （ 3 ）基于抗原-抗体配对结果，建立了三种模式ELISA方法：模式一， M3-OVA/mAb-D4G6；模式二，M3-OVA/mAb-D2G6；模式三，D3-OVA/mAb-D4G6。并对三种ELISA检测方法条件参数进行优化，建立ELISA检测方法标准曲线。三种ELISA方法检测参数如下：模式一，特异性检测TBBPA-MHEE， IC50为2.53 ng/mL，线性范围为0.51-12.56 ng/mL，LOD为0.12ng/mL；模式二，特异性检测TBBPA-DHEE，IC50为6.34 ng/mL，线性范围为1.31-30.76 ng/mL，检测限LOD为0.79 ng/mL；模式三，同时识别TBBPA-DHEE与TBBPA-MHEE，IC50分别为2.56 ng/mL、3.11 ng/mL ，线性范围分别为0.85-7.71 ng/mL、0.76-12.7 ng/mL，LOD分别为0.53 ng/mL、0.68 ng/mL。 （4）对典型污染区域样本进行采集，包括电子垃圾拆解地（浙江省台州市）、BFR生产厂家（山东省寿光市、湖南省浏阳市），并应用建立的ELISA检测分析方法对区域环境样本中TBBPA-DHEE、TBBPA-MHEE的污染浓度水平进行测定。在台州市的样本中，TBBPA-DHEE的水样检出率为73.91%，土壤样本检出率为83.33%，但是在样本中TBBPA-MHEE的检出率很小，该区域环境主要受到TBBPA-DHEE的污染。在寿光市的样本中，TBBPA-DHEE的样本检出率达100%，最高浓度为4.02 ng/mL，平均检出浓度高于台州市。在浏阳市采样的水样中，两种物质均为未检测到，只在工厂废水排放口附近的土壤样本中检测TBBPA-DHEE。应用环境影响度与健康风险评价两种方法评估典型污染区域环境内两种物质的潜在风险，发现两种物质的在台州市与寿光市儿童的健康风数值均高于成人，因此儿童更容易受到TBBPA-DHEE和TBBPA-MHEE的影响。

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