高性能硼亲和固定相的设计、制备与应用研究

摘要

在糖组学、代谢组学以及蛋白组学研究中，顺式邻二羟基分子（CDMs），如多糖、核苷和糖蛋白发挥着重要的作用，并且许多该类分子被当作癌症早期诊断的标记物质。但是，实际生物样品的成分复杂，存在许多干扰物质，而且顺式邻二羟基分子的丰度往往很低。所以，在进行检测前，以顺式邻二羟基分子为目标的富集分离操作是研究这类生物分子的关键步骤。硼亲和材料可以和顺式邻二羟基分子形成可逆的环状酯，具有pH开关的性质，并且不会破坏样品的结构，是一种比较理想的分离富集顺式邻二羟基分子的方法，本论文发展了一系列高性能硼亲和固定相，并系统地研究了其分离富集性能，具体研究内容如下： （1）发展可以高通量处理生物样品中顺式邻二羟基分子的方法对研究此类生物分子是非常重要的。在第一章中，通过表面引发原子转移自由基聚合反应（SI-ATRP）在硅胶表面形成的聚GMA刷，使苯硼酸配基的结合位点大幅度增加，氨基功能化的邻二甲胺苯硼酸配基与GMA中环氧基团的开环反应可固载苯硼酸配基，从而提升了硼亲和固定相的保留容量。同时生成的羟基，提高了材料的亲水性，由于材料疏水作用的减弱，使得材料的非特异性吸附明显降低，FT-IR和元素分析被用于证明聚GMA刷与邻二甲胺苯硼酸配基成功修饰在硅胶表面。另外，通过测试，该固定相的结合pH值低至5.5，这主要是由于邻二甲胺苯硼酸配基较低的pKa值（6.7）。该固定相既可以在弱酸性环境下结合顺式邻二羟基分子，又可以高通量地处理生物样品。 （2）现有的硼亲和材料多数只能实现顺式邻二羟基分子与非顺式邻二羟基分子的分离，对富集到的顺式邻二羟基分子缺乏进一步的分离能力，往往需要额外的反相或亲水作用色谱柱进行分离，这既增加了分析的步骤又会对分析的结果造成不利的影响。因此发展在同一根色谱柱上同时分离非顺式邻二羟基与多种顺式邻二羟基的方法是很有必要的，其可以避免在更换色谱柱和转移样品时而产生的误差。第二章中,我们在硅胶表面引入C12基团和邻二甲胺甲基苯硼酸配基，使制得的固定相同时具有硼亲和、反相、阴离子交换作用（AE），并通过FT-IR和元素分析手段进行表征。其中硼亲和作用由材料表面邻二甲胺甲基苯硼酸配基支持，可特异性结合顺式邻二羟基分子。而C12基团和配基中的氨基分别赋予该固定相反相作用和阴离子交换作用。并且在反相作用下，该材料成功分离了苯系物、核苷类物质、多环芳烃化合物、苯酚类物质、磺胺类物质以及苯胺类物质。在阴离子交换作用下，该材料成功分离了多种无机阴离子化合物。同时，该材料实现了通过切换流动相，对尿样中的核苷的选择性富集和离线二维分离。 （3）结合pH值是影响硼亲和材料结合顺式邻二羟基分子的一个重要因素。在第三章中，我们设计合成出具有较低pKa值的4-羧基-邻羟甲基苯硼酸半酯配基，并使用NMR进行表征。通过聚乙烯亚胺（PEI）使苯硼酸配基键合在硅胶表面，PEI含有大量氨基，扩大了苯硼酸配基的结合位点，从而提升的固定相的保留容量，而且剩余未反应的氨基提升了固定相的亲水性，抑制了疏水作用对顺式邻二羟基分子的非特异性吸附，FT-IR、元素分析、SEM和zeta电位等表征手段用于证明PEI与4-羧基-邻羟甲基苯硼酸半酯配基成功修饰在硅胶表面。实验证明，该固定相具有很低的结合pH值，在pH为4.0的环境下仍可以结合胞苷。该固定相也显示出非常优秀的硼亲和性能，在酸性条件下可以实现对多种核苷的二级分离。实现了仅在硼亲和作用下同时分离非顺式邻二羟基与多种顺式邻二羟基分子的目标。

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