LncRNA PIK3CD-AS1在肾癌细胞中的功能和机制初步研究

摘要

目的： 探讨LncRNA PIK3CD-AS1在肾癌细胞中的表达情况，以及PIK3CD-AS1对肾癌细胞增殖能力及其凋亡的影响，并探讨可能的分子作用机制。 方法： 运用实时荧光定量PCR检测LncRNA PIK3CD-AS1在正常肾脏细胞（HK-2）与多种肾癌细胞（ 769-P、786-O、A498 ）中的差异表达，通过构建PEGFP-N1-PIK3CD-AS1重组质粒，并将其转染入PIK3CD-AS1表达最低的肾癌细胞，构建稳定过表达PIK3CD-AS1的细胞株。通过增殖实验及凋亡实验检测过表达细胞的增殖能力及凋亡水平从而探讨PIK3CD-AS1 对肾癌细胞增殖及凋亡的影响。通过细胞增殖或凋亡相关基因表达谱芯片筛选出与PIK3CD-AS1对肾癌细胞增殖或凋亡影响可能存在相互作用的基因。通过Western-blot检测PIK3CD-AS1 高表达的细胞中pAKT蛋白含量的变化，进一步探讨PIK3CD-AS1具体作用机制的研究奠定基础。 结果： 与正常肾脏细胞HK-2 相比较， LncRNA PIK3CD-AS1 在多种肾癌细胞（769-P、786-O、A498）中表达量明显下降（P＜0.05），其中在769-P细胞中下降最为明显（P＜0.01）。成功构建PIK3CD-AS1过表达载体后，将其转染入769-P细胞再经G418药物筛选，成功得到PIK3CD-AS1稳定过表达的769-P细胞株，经实时荧光定量PCR验证，筛选后的 769-P细胞株中PIK3CD-AS1 表达量较阴性对照细胞明显增高（P＜0.05）。通过增殖实验检测发现，PIK3CD-AS1高表达的细胞较阴性对照组细胞的增殖能力明显下降（P＜0.01），而细胞凋亡率较阴性对照组细胞明显上升（P＜0.01）。通过凋亡相关基因表达谱芯片，筛选与PIK3CD-AS1促凋亡能力相关性较大的基因，并通过Morpheus网页软件绘制热图，结合相关文献选取出三个基因（DFFA、BCL2L1、CASP9）进行多次验证，发现基因DFFA和BCL2L1 在PIK3CD-AS1 高表达细胞中的表达量较阴性对照明显降低（P＜0.01），已有较多文献报道DFFA、BCL2L1基因可抑制细胞凋亡；同时基因CASP9的表达较阴性对照组细胞明显增高（P＜0.01），较多文献报道CASP9可促进细胞凋亡。Western-blot结果显示上调PIK3CD-AS1的表达后，肾癌细胞中pAKT含量明显下降。 讨论： 通过我们的研究可以发现LncRNA PIK3CD-AS1很可能是一种抑癌因子，在多种肾癌细胞中表达普遍明显降低，并且发挥着抑制肾癌细胞增殖和促进凋亡的作用。其机制可能是 PIK3CD-AS1 影响 pAKT 蛋白的表达进而引起PI3K-AKT-mTOR 信号通路的改变，使 DFFA、BCL2L1、CASP9 三种基因异常表达，以达到促进肾癌细胞凋亡作用，同时PI3K-AKT-mTOR信号通路的改变对肾癌细胞的增殖也有一定的影响。因此，LncRNA PIK3CD-AS1作为一种抑癌因子，很可能可以成为治疗肾癌的一个新的靶点。

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