炎症因子TNF-α可影响小鼠MC3T3-E1细胞系的N-cadherin表达及其体外造血支持能力

摘要

目的 系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）患者可以出现血液生成异常，但目前其机理尚不清楚。造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）的分化和自我更新等受骨髓造血微环境调节。而骨髓造血微环境中一些细胞成分，可以通过其表面粘附分子如N-cadherin等与HSCs的相互作用，从而参与调节血液生成。SLE患者体内常有多种炎症因子如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α等异常增高，而这些异常水平的炎症因子除了作用于HSCs外，还可以影响骨髓微环境中的骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）、成骨细胞（osteoblast，OB）等细胞成分，通过对这些造血调节细胞来间接干扰正常的血液生成。 本研究拟在体外模拟炎症因子TNF-α作用于小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1和BMMSCs，探索其对这两种细胞N-cadherin表达水平的影响及可能机制；并初步探索经TNF-α预处理的MC3T3-E1细胞，对纯化的小鼠Sca-1细胞体外扩增的支持作用。期望通过上述研究，初步揭示SLE患者血液生成障碍发生的可能机制。 方法 1、首先，用不同浓度（10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml）的TNF-α处理MC3T3-E1细胞3天，Western blot法检测其表面粘附分子N-cadherin的表达，筛选出合适的TNF-α浓度以进行后续实验。然后，用选定浓度的TNF-α分别处理小鼠MC3T3-E1细胞和BMMSCs不同时间，并在TNF-α处理MC3T3-E1细胞3天后，换成不含TNF-α的培养液继续培养不同时间，采用Western blot法检测N-cadherin、p-Erk1/2及p-Akt的表达。 2、用CCK8法检测经不同浓度（0~80μM）的Erk抑制剂FR180204处理MC3T3-E1细胞不同时间（1天、2天、3天）后细胞的增殖抑制情况，筛选出合适的抑制剂浓度。用选定浓度的抑制剂处理MC3T3-E1细胞，采用Western blot法检测N-cadherin和p-Erk1/2的表达。 3、分离小鼠股骨和胫骨并收集骨髓，磁珠阳性分选富集小鼠Sca-1+的骨髓细胞，用流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测所分离Sca-1细胞的阳性比例。 4、先用造血干细胞体外扩增专用培养液StemspanSFEM体外培养MC3T3-E1细胞，分别观察和检测不同时间点的细胞形态和N-cadherin表达情况，并与在含有10%FBS的α-MEM培养液条件下生长的MC3T3-E1细胞的结果进行比较。然后，用含TNF-α的StemspanSFEM培养液体外培养MC3T3-E1细胞，3天后更换成不含TNF-α的StemspanSFEM培养液继续培养不同时间点，Western blot法检测细胞N-cadherin的表达。 5、将TNF-α预处理的MC3T3-E1细胞作为饲养层，在造血支持因子SCF、TPO及Flt3-Ligand条件下，体外扩增小鼠Sca-1+骨髓细胞一周，随后进行集落形成单位（colony-forming units，CFU）检测。 结果 1、MC3T3-E1细胞经TNF-α处理后，其细胞表面N-cadherin的表达水平下降，并且在一定的浓度范围内随TNF-α浓度的提高而更加显著。根据实验结果，选择20 ng/ml的浓度应用于后续实验。 2、20 ng/ml浓度的TNF-α处理MC3T3-E1细胞后，N-cadherin的表达水平在短时间内无明显变化，在培养1天和2天后明显下调；而在去除TNF-α后继续体外培养7天后，MC3T3-E1细胞的N-cadherin表达上升至高于基础水平。在20 ng/ml浓度的TNF-α作用下，MC3T3-E1细胞的p-Erk1/2表达水平在1天内均保持高于基础水平；在去除TNF-α作用后，与N-cadherin相反，p-Erk1/2表达在继续培养7天后下降至低于基础水平。 3、TNF-α处理小鼠BMMSCs后，短时间（30min和3h）内，N-cadherin和p-Erk1/2的表达水平升高；处理3天后，N-cadherin、p-Erk1/2的表达均逐渐降至基础水平之下。在去除TNF-α后继续培养的过程中，BMMSCs的N-cadherin表达可上升至高于基础水平，p-Erk1/2的表达则继续下降。与p-Erk1/2不同， BMMSCs的p-Akt表达水平在TNF-α处理的整个过程中均无明显变化。 4、根据Erk抑制剂FR180204对MC3T3-E1细胞的增殖抑制作用情况，选定7.5μM和10μM两个浓度进行后续实验。与对照组相比，经7.5μM和10μM两种浓度Erk抑制剂处理1天后，MC3T3-E1细胞的p-Erk1/2表达水平均受到明显抑制。在用抑制剂处理的整个过程中，N-cadherin的表达水平均明显高于对照组。 5、小鼠骨髓细胞经Sca-1抗体的免疫磁珠阳性分选富集后，流式细胞术检测Sca-1阳性细胞的比例均在90%以上。 6、MC3T3-E1细胞用StemspanSFEM培养液培养后，细胞形态与在含有10%FBS的α-MEM条件下培养的细胞无明显区别，并且N-cadherin的表达水平也无明显差异。不同浓度（10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml）的TNF-α处理3天后， N-cadherin表达明显低于基础水平。用20 ng/ml浓度的TNF-α处理3后，在去除TNF-α继续培养的一周内，细胞的N-cadherin表达均保持在高于基础水平。换用StemspanSFEM培养液后，TNF-α对MC3T3-E1细胞N-cadherin表达的影响类似于其在含有10%FBSα-MEM条件下培养的结果。 7、以TNF-α预处理的MC3T3-E1细胞作为饲养层，在造血支持因子SCF、TPO及Flt3-Ligand条件下，体外扩增小鼠纯化的Sca-1+骨髓细胞后，其总CFU数目低于对照组，CFU-pre-B数目较对照组明显升高，BFU-E及CFU-GM数目较对照组显著降低。 结论 炎症因子TNF-α在作用于小鼠前成骨细胞MC3T3-E1和BMMSCs后，可影响细胞的N-cadherin表达水平和Erk1/2的磷酸化。TNF-α对N-cadherin表达水平的影响可能与Erk1/2通路有关。经TNF-α预处理后N-cadherin高表达的MC3T3-E1细胞在与小鼠Sca-1+骨髓造血细胞相互作用过程中，对骨髓造血细胞的分化和增殖均可以产生影响。我们的研究提示，SLE骨髓微环境中造血支持相关细胞粘附分子N-cadherin的异常，可能是骨髓血液生成异常的机制之一。

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第一章 引 言

成骨细胞可在体内由骨髓MSCs分化而来，或通过地塞米松、β-甘油磷酸和维生素C在体外诱导形成。MC3

第二章 实验材料、方法

2.1 实验材料与器械

2.1.1 实验对象

2.1.2 主要实验试剂

2.1.3 主要实验仪器及耗材

2.2 溶液的配制

2.3 实验方法

2.3.1 实验分组

2.3.2 超净台的使用

2.3.3 小鼠的BMMSCs的分离及原代培养

2.3.4 小鼠的BMMSCs的传代培养

2.3.5 小鼠Sca-1+ 骨髓细胞的分离纯化

2.3.6 小鼠Sca-1+ 骨髓细胞的传代培养

2.3.7 MC3T3-E1的传代培养

2.3.8 实验细胞的冻存

2.3.9 实验细胞的复苏

2.3.10 TNF-α处理贴壁细胞

2.3.11 MC3T3-E1与Sca-1+ 骨髓细胞的共培养

2.3.12 细胞增殖试验（CCK8法）

2.3.13 小鼠Sca-1+ 骨髓细胞的比例测定

2.3.14 贴壁细胞总蛋白的提取

2.3.15 蛋白浓度测定

2.3.16 蛋白印迹法（Western blot）

2.3.17 MethoCult半固体培养基的分装

2.3.18 Sca-1+ 骨髓细胞的集落形成单位实验（CFU）

2.4 统计学方法

第三章 实验结果

3.1 TNF-α浓度的筛选

3.2 实验细胞经TNF-α处理后N-cadherin、p-Erk1/2以及p-Akt的表达

3.2.1 MC3T3-E1经TNF-α处理后其粘附分子N-cadherin的表达

3.2.2 MC3T3-E1经TNF-α处理后其p-Erk1/2及p-Akt的表达

3.2.3 小鼠BMMSCs经TNF-α处理后其N-cadherin、p-Erk1/2和p-Akt

3.3 Erk抑制剂浓度的筛选

3.4 Erk抑制剂处理MC3T3-E1后N-cadherin和p-Erk1/2的表达

3.5 小鼠Sca-1+ 细胞在骨髓细胞中的比例

3.6 StemspanSFEM培养液对细胞形态以及N-cadherin表达的影响

3.7 TNF-α预处理的MC3T3-E1细胞对Sca-1+骨髓造血细胞体外扩增和分化的影响

第四章 讨 论

第五章 结 论

参考文献

致 谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文